常用的蛋白质定量方法有BCA法、Lowry法、考马斯亮蓝法和紫外分光光度法。试剂盒中，最常用的标准品是牛血清白蛋白（BSA）。
一、BCA法
BCA（Bicinchoninic acid）法是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人上的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将CU（上标2＋）还原为cu（上标＋），Cu（上标＋）与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值。并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Trition X－100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。
二、Bradford法
Bradford比色法是基于考马斯亮蓝G－250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸／三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2－巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入0．5mg／ml牛血清白蛋白（5、10、15和20L），以0．15mmol／LNaCl补足至100 L，同时以两管100L的0．15mmol／L NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2min。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。
Bradford的dye－binding method是利用Coomassie brilliant G－250（CBG）可与蛋白质结合而变色的特性来定量（Bradford，1976）；若试样中的蛋白质量较多，则结合到蛋白质而变色的CBG也多，因而呈色较深。下例是以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质量与吸光度的标准校正线。
【实验前准备】
（1）仪器用具ELISA光度计（Dynatech）可在1min内测完一片滴定盘微量滴定盘（microtiter），Micro test tubes，大头针或喷火枪。
（2）药品试剂Buffer A－O；BSA标准品（Bio－Rad，bovine serum albumin100μg／ml）；未知浓度样本（unknown BSA，0．8ml）；Dye Reagem（Bio－Rad 500－0006）先以水稀释4倍备用。以染料Coomassie brilliant blue G－250配制的溶液，勿与胶体电泳染色用的CBR－250混淆，各有其使用上的特色，不要互用。
（3）标准品及样本
①标准品系列：使用小试管准备一组BSA（b）标准品的系列稀释。
标记BSA标准品（μl）BufferA－O（μl）终浓度（μg／ml）
#5 500 0 100混合均匀
#4 400 100 80混合均匀
#3 300 200 60混合均匀
#2 200 300 40混合均匀
#1 100 400 20混合均匀
#0 0 500 0混合均匀
配制一定要精准，否则校正直线不会很准确；各种试剂的添加，若自稀往浓取样，则可以不用换吸管头。
标记未知样本BufferA－O终浓度
X（下标1）500μl 0μl 2×混合均匀
X（下标2）250μl 250μl 1／2×混合均匀
②未知样本：准备两种未知样本。
③一般样本：通常由色谱层析法所收集到的各分层样本，都可以直接进行蛋白质定量分析；但若其中含有某些干扰因子（如含有Triton），或样本的浓度太浓，都必须将样本稀释后再测。同一样本的若干不同稀释浓度，所测出来的最终蛋白质浓度会有差异，通常是以稀释度大者较为准确。
【操作步骤】
（1）每槽先加好50μl标准品（#0，#1…#5）或未知样本［x（下标1），x（下标2）］，加入96孔滴定盘中，共两个平行孔。
（2）每槽再加入200μl Dye－Reagent（d），在全部样本槽加完前，不要中断添加；同时小心避免气泡产生。
（3）轻拍滴定盘一侧，使添加的各成分均匀混合，注意Dye－Reagent密度较大，很容易沉积在下方而分层。若还有小气泡，小心以大头针刺破，大量时可用喷火枪火焰烧破。
（4）静置室温10min。
（5）以ELISA reader测量570nm（或595 nm）的吸光值。
三、双缩脲法
当需要快速，但不很准确的测定中，常使用双缩脲法。双缩脲法的原理是Cu（上标2＋）与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0．5～1Og／L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如：Tris缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10％冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的lmol／L NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
四、紫外分光光度法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0．1～0．5mg／ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须做适当校正。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此浓度为0．1％的各种蛋白质在280nm处的吸光系数在0．5～2．5之间变化。所有的噩白质在230nm以下都有强吸收。例如，0．1％牛血清白蛋白的消光系数α在225nm和215nm处分别为5．0和11．7，而在280nm处为0．58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此该值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10～100μl／ml的蛋白质。
缺点：该方法不是严格的定量，因为此法是根据酪氪酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（TrP）残基的强吸收值来测定的。不同的蛋白质具有不同的消光系数，如果一种蛋白质中没有上述3种残基，此法就不能检出，但对于粗提蛋白成分的混合物来说，此法合适。
【实验前准备】
（1）试剂实验用缓冲液（空白对照）。
（2）设备分光光度计（配备紫外档）、石英比色杯、移液管和吸球。
【操作步骤】将缓冲液和待测样品分别加入比色杯，用对照杯（实验用缓冲液）调零，记录各样品的光吸收值。
【注意事项】
（1）通常误认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1．0时，蛋白质溶液浓度大约为1mg／ml，这是很不精确的。以下比较了不同的标准蛋白质在1mg／ml时的光吸收值。
（2）玻璃和塑料在紫外吸收光范围内具有光吸收值，因而不能用来进行蛋白质的定量。
（3）当有核酸存在时，可进行如下修正：蛋白质浓度（mg／ml）＝1．5×A（下标280）0．75×A（下标260）。
（4）如果测量值超过测量范围，应将样品用缓冲液稀释后再测量，或使用更小的比色杯测量。
表5－3不同的标准蛋白质在1mg／ml时的光吸收值
蛋白质A（下标280）蛋白质A（下标280）
牛血清白蛋白0．70γ－球蛋白1．38
核糖核酸酶A 0．77胰蛋白酶1．60
卵白蛋白0．79胰凝乳蛋白酶2．02
肠毒素1．33α－淀粉酶2．42
