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第105章 膜片钳技术

膜片钳技术又称单通道电流记录技术,用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面,使之形成10~100的密封(glga—seal),被孤立的小膜片面积为微米量级,内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位,可测量单个离子通道开放产生的pA(10A)量级的电流,这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化,可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量,并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来,以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。

一、常用记录方式

包括两大类四种。第一大类单通道记录(sigle channel recording)包括三种:①细胞吸附式(cell attached Patch)将两次拉制后,经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面,形成高阻封接,在细胞膜表面隔离出一小片膜,即通过微管电极对膜片进行电压钳制,从而测量膜电流;②内面向外模式(inside—out patch)高阻封接形成后,将微管电极轻轻提起,使其与细胞分离,电极端形成密封小泡,在空气中短暂暴露几秒钟后,小泡破裂再回到溶液中,使小泡的外半部分破裂即得;③外面向外模式(outside—out pateh)高阻封接形成后,继续以负压抽吸,膜片破裂,再将玻管慢慢从细胞表面提起,断端游离部分自行融合成脂质双层而得到。第二大类即全细胞模式(whole cell mode)在细胞吸附式的基础上,继续以负压抽吸,使电极管内细胞膜破裂,电极内液与胞内液直接相通而得到,此方式既可记录膜电位又可记录膜电流。全细胞记录反映的是整个细胞膜上所有离子通道电滔动的总和。全细胞记录的优点在于,能保持细胞及其反应性的完整性。这样可以在细胞水平上观察受药物的作用后神经元电活动的总体反应特点。当应用特异的阻断剂,还可凸显某一类离子通道的特点。不足之处是由于电极与细胞间交换快,细胞内环境很容易破坏,因此记录所用的电极液应与胞浆主要成分相同,如高K+,低Na+和Ca2+及一定的缓冲成分和能量代谢所需的物质。另外,近年来由全细胞模式派生的穿孔式膜片的全细胞记录法也是克服以上缺点的有效方法。记录中应注意解决好膜电容干扰及通路电阻的补偿两个造成误差的环节。

二、应用

(1)膜片钳技术可以用来分析心肌静息电位及其自发去极化的机制,对钠、钾、钙和乙酰胆碱通道的调控机制进行更深入的了解。此外,膜片钳技术也可以用来分析心脏在病理状态下引起通道活性和受体功能改变的机制,从而可以从根本上对各种心脏病进行诊断和治疗。

(2)应用膜片钳技术可以研究神经信号的产生和传导。由于中枢神经系统的脆弱性和难以接近性,研究脑的网络特性及其复杂的调控功能是十分困难的。在具有简单网络系统的离体脑片上应用膜片钳技术,为这一方面的深入研究开辟了一个崭新的领域。

(3)药物研制的关键在于探测药物作用的靶点。在药物筛选中,将目的药物以吹打或灌注方式直接施加于培养细胞,借助特定离子通道阻断剂,利用膜片钳方可迅速判明药物作用及作用方式等问题。因此,膜片钳对于药品的研制与生产也有着十分巨大的促进作用。

(4)胃肠道平滑肌、血管平滑肌与离子通道的关系研究。

(5)此外,膜片钳技术还可以应用于物质转运、细胞分泌、信号转导、中医理论等众多区域中。由于对生命科学产生了巨大的推动作用,膜片钳技术被人们称为可以与基因技术并驾齐驱的革命性技术。

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