（4）对于有刺激的样品，建议以病理检查确证，判断对肌肉组织损伤的具体类型。
（5）如受试物有刺激，应进行停药后恢复期的观察，判断刺激是否为可逆性，一般观察至注射后72h。
（五）直肠刺激性实验
1．动物选择
家兔是最适宜的种属，也可选用犬。动物数每组不少于3只，家兔体重2．5～3．Okg，犬体重6～8kg。雌雄不拘。应设生理氧化钠溶液或溶剂对照。
2．操作步骤爰观案指标
给药容积可参考拟订的人体治疗容积或不同动物种属的最大给药量。给药频率根据临床应用情况而定，通常每天l～2次，至少7天。
分别将受试样品置入动物直肠内。每次给药与黏膜接触至少2～4h，必要时可封闭肛门一定时间。给药后观察动物临床表现（如疼痛症状）和粪便（如血、黏液）及动物的死亡情况。于末次给受试物后24h处死动物，取出肛门区域黏膜和肛门括约肌，观察有无充血、红肿等现象，并进行肛周黏膜的病理组织学检查。
3．结果评价
根据肉眼观察和组织病理学检查的结果进行综合判断。
4．注意事项
（1）药物暴露时间通常与人一致，通常封闭肛门采用惰性塞子。
（2）直肠刺激性实验的设计很少被固定下来成为正规程序，可以采用一些共同的主观分级打分方法来评价反应。
（六）阴道刺澈性实验
1．动物选择
首选家免，也可选用大鼠或犬。动物数每组不少于3只。家兔体重2．5～3．0kg，大鼠体重250—300g，犬体重6—8kg。全部雌性。应设生理氯化钠溶液或溶剂对照。
2．操作步骤及观察指标
将受试样品置人动物阴道内。每次给药与黏膜接触至少2～4h。给药后观察动物临床表现（如疼痛症状）和阴道分泌物（如血、黏液）及动物的死亡情况。于末次给受试物后24h处死动物，取出阴道腔及子宫，观察有无充血、红肿等现象，并进行阴道黏膜的病理组织学检查。
3．结果评价
根据肉眼观察和组织病理学检查的结果进行综合判断。
4．注意事项
（1）相当多的研究表明阴道刺激实验首选家兔，家兔注意选择未怀孕过的，但是现在一些研究认为家兔太敏感，因此推荐应用摘除卵巢的大鼠，摘除卵巢可使阴道薄厚一致、具有没有角化的上皮。
（2）预先将受试物加热至37℃，一般栓剂会融化，为避免片剂物理损伤黏膜，先溶解在灭菌注射用水中。
（3）给药方法建议将润滑的18号橡皮管或长灌胃针头连接在注射器上，用于定量投递受试物，家兔插入的深度大约7．5cm，一般给药体积为1ml；大鼠给药深度为2．5cm，体积为0．2ml。
（4）受试物剂量应为人拟用剂量（或浓度），可以用一个假阴性对照（将导管插入阴道但不给药或给灭菌注射用水），一个赋形剂对照和一个阳性对照（一般为2％壬苯醇醚-9）
（5）多次给药依据临床而定，一般为10天。
（6）阴道刺激肉眼观察标准见表4—10，病理检查评分标准见表4—11，分级和可接受范围见表4—12。
表4—10黏膜刺激肉眼观察标准
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标准分值标准分值
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红斑：中度水肿（明显隆起）2
无红斑0重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚3
轻度红斑（勉强可见）1严重水肿（皮肤隆起1mm以上并有大）4
中度红斑（明显可见）2分泌物：
重度红斑3无分泌物0
紫红色红斑到轻度焦痂形成4非常轻度分泌物1
水肿：轻度分泌物2
无水肿0中度分泌物3
轻度水肿（勉强可见）1大量分泌物（弄湿阴道周围相当大的范围）4
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最高总分值12
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表4-11黏膜刺激病理检查评分标准
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标准分值标准分值
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上皮：充血：
完整—正常0无充血0
细胞变性或上皮变平1最少1
转化2轻度2
灶性腐蚀3中度3
腐烂或溃疡、扩散4明显并有血管紊乱4
白细胞：水肿：
无0无水肿0
最少：＜25高倍镜1最少1
轻度：25—50高倍镜2轻度2
中度：50—100高倍镜3中度3
明显：100以上4明显并有血管紊乱4
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最高总分值16
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表4-12黏膜刺激分级和可接受范围
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打分分级可接受性
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0无刺激性
1-4最小刺激性可接受
5-8轻度刺激性
9-11中度刺激性9-10临界水平
12-16明显刺激性11或更大不能接受
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（七）滴鼻剂、喷雾剂及滴耳剂刺澈性实验
1．动物选择
可以选择家兔、豚鼠或大鼠，其中大鼠应选择SPF级动物。每组至步3只动物，雌雄不拘。动物体重家兔2．0—3．0kg，大鼠、豚鼠250～300g。
大鼠及豚鼠应选择雌雄分笼饲养，家兔宜选择单笼饲养。自由饮食、摄水，饲料应为适合所选动物的全价颗粒营养饲料（豚鼠应注意补充维生索c），家兔及豚鼠饮用水起码应符合人用自来水标准，大鼠饮用水应符合SPF级动物标准。动物房温度，家兔及豚鼠宜控制在18～26℃，相对湿度为40％—70％；大鼠宜控制在20—25℃，相对湿度为40％～70％。换气次数应为每分钟10～20次。如果用人工光线照明，应12h明暗交替。
2．操作步骤及观察指标
每天上下午各给药1次，每次于一鼻腔中滴入0．02ml，一般采用与临床制剂相同浓度，设一个临床剂量或高于临床剂量组，给药期视临床给药时间而定，禁食18h，麻醉放血处死，取鼻腔、喉头、气管、肺、食管进行病理学检查。
喷雾剂可选择家免、豚鼠或大鼠，将动物置于喷雾室，每次给药与黏膜接触至少2～4h，给药期视临床而定。给药后观察动物垒身状况（呼吸、循环、中枢、神经系统）及局部刺激症状（如哮喘、咳嗽、呕吐、窒息等症状）。末次给药24h后处死动物，观察呼吸道局部（鼻、喉、气管、支气管）黏膜组织有无充血、红肿等现象，并进行组织病理学检查。
滴耳剂刺激性实验可以参照上述实验，用家兔或豚鼠，给药途径为外耳道给药。观察对外耳道和鼓膜的影响。
根据肉眼观察和组织病理学检查结果进行综合判断。
3．注意事项
制作鼻腔病理检查标本时，应先除去头部皮肤、肌肉、下颚、眼球、脑等，然后从鼻腔注入10％中性甲醛洗净，用甲醛固定头部。头盖骨用10％甲酸甲醛脱钙后再对左右鼻腔上中下部位切片、染色、光镜检查，比较左右鼻腔的病理组织变化。
（八）口腔用药和滴耳剂刺激性实验
1．动物选择
口腔黏膜给药可选择金黄仓鼠，每组至少3只动物，雌雄不限。体重120～150g。
金黄仓鼠雌雄分笼饲养，自由饮食、摄水，动物房温度宜控制在18～26℃，相对湿度为40％—70％。换气次数应为每分钟10—20次。如果用人工光线照明，应12b明暗交替。
2．操作步骤殛观察指标
一般采用与临床制剂相同浓度，设一个临床剂量或高于临床剂量组。给药频率根据临床应用情况而定。
取健康成年仓鼠，雌鼠应无孕，口腔双侧颊囊应无病变，每组3只。实验当日，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30～60m／kg），翻转动物用生理氯化钠溶液清洗颊囊，检查无异样。将供试药液浸湿的直径约5咖的灭菌脱脂棉球，放人动物一侧颊囊内，另一侧放人生理氯化钠溶液或赋形剂浸湿的灭菌棉球，每次接触时间依临床实际使用时间而定（但不能少于5min），多次给药时，每次接触后取出棉球后应观察两侧颊囊膜刺激反应，有无充血、肿胀、糜烂、溃疡，并用生理氯化钠溶液冲洗颊囊。最后一次接触后24h，对颊囊常规切片，观察组织。
3．结果评价
根据肉眼观察和组织病理学检查的结果进行综合判断。
4．注意事项
（1）为防止棉球移出，可以给每只动物套上一个3～4mm宽的项圈。
（2）可参照表4～11标准进行病理检查评分，按表4—12标准进行分级和判断町接受范围。
三、影响刺激性反应和实验结果的因素
局部组织刺激性实验，由于在实验设计或技术方面存在相对小的差异，所以其结果常有很多变异性。well和scala（1971年）为，清楚地表明这个事实，整理和报道了最有名的几个实验室间的研究。尽管将上述已证明能获得重复性结果的方法交给有几年经验的技术人员，并且实验含有一些内标对照（在PDI中的阳性和赋形剂对照），结果出现大的变异并发生假阳性或假阴性结果，但是，能够认识到影响实验结果的那些因素仍然是重要的。这些因素有：
（1）在一般情况下，增加通过真皮层或黏膜吸收的任何因素，也将增加内在反应的严重性。除非这种因素反映了潜在暴露条件，换句话说，它可能严重影响实验结果的相关性。
（2）在实验和解释结果之前，一定谨慎考虑固体的物理特性，如固体的形状（尖锐的边缘）、大小（在包裹中，小的颗粒通过前后摩擦可能擦伤该处皮肤）、硬度（坚硬的纤维或非常硬的颗粒可能具有物理刺激性），以上物理特性均可促进刺激性反应。
（3）当应用干燥物质实验与应用湿化物质实验相比时，固体经常得出不同的结果。在一般情况下，固体如果湿化将具有更大的刺激性（湿化是有助于促进吸收的因素）。同时也应该小心选择湿化制剂，《美国药典》已经证明一些批号（少数）的生理氯化钠溶液（用于模拟汗液）它们本身对皮肤和黏膜具有轻度刺激性，除了水或氯化钠溶液之外，不应该应用其他的液体。
（4）如果患者的处理区域是在减弱皮肤表面屏障的部位（如切伤或烧伤），那么有些实验动物也同样在减轻皮肤表面屏障的部位敷用，这个程序是根据擦伤皮肤均对刺激性更敏感的假设而建立的。但是实验已表明这种情况不一定是准确的。有些物质对擦伤皮肤产生更大刺激性，而其他物质产生较小刺激性。
（5）封闭程度（事实上是包裹整个实验部位的紧密程度）也改变透皮吸收，进而改变刺激性。在实验室一个重要的质量控制问题是，在皮肤包裹中取得可重复性的封闭程度。
（6）受试动物的年龄和敷用部位（背部的鞍部与侧面）也能够显著改变实验结果。在皮肤刺激性实验中，目的是排除所有的这种变异来源。在一般情况下，随着动物年龄的增长，对刺激性的敏感性下降。对于皮肤实验，背部中央皮肤（而不是直接整个脊背）趋向于比侧面厚（因此对刺激性具有较小敏感性）。
（7）受试动物的性别也能够改变研究结果，因为局部的皮肤厚度和皮肤表面血流量在雄性和雌性之间有些差异。
（8）最后，影响结果和影响这些急性研究成果的单一最重要因素（也是经常被忽视的因索）是技术人员的培训。在决定如何制备和应用受试物、如何预防主观打分的情况下“读取”结果以及其准确度和精密度在相当大程度上依赖于涉及的技术人员。为了获得预期结果，开始的培训必须细致而全面。相当重要的是必须实施一些形式的定期培训，特别是在打分确定结果方面，推荐应用一套彩色标准照片作为培训和参考的工具。这种标准应该清楚地表明Draize皮肤打分中分级的每一种情况。
（9）应该承认皮肤刺激性实验是排除假阴性结果的偏态设计，因此，倾向于夸大人类可能发生的相关的结果。药物的刺激性可以忽略不计（甚至非常低的轻度刺激），该刺激对于皮肤刺激性评价没有价值，但是在宴验中应用大量药物和延长皮肤接触就可以提供有价值的信息。
四、替代法
药物的肠胃外制剂的肌内和静脉注射可能产生系列不适，包括疼痛、刺激性和（或）对肌肉或血管组织的损害。应用整体动物模型对损害进行组织病理学评价，通常使用家兔，可通过测量注射部位周围组织中被释放的肌苷磷酸激酶的量，使该体内方法更客观和定量。目前，应用从大鼠来源的培养的骨骼肌细胞系（L6）的方案作为模型，已经在11个药品实验室中对实验室间有效性程序进行了评价。该方法是在该细胞暴露于相关制剂之后，测量培养基中的肌苷激酶水平，并根据这个终点预测整体肌内折射损害。通过一系列抗生素的实验，得到了好的分级相关性结果的报告。日前多个实验室的评价覆盖了化合物较宽的结构范围，并已表明与抗生索的体内结果具有好的定量相关性，对于较宽的系列肠胃外药物产品也具有好的相关性。此外，建议应用从大鼠来源的培养的原代骨骼肌纤维作为模型，通过肌苷磷酸激酶的释放评价损害；应用6个肠胃外给予的抗生索的评价（将它们的EC50”分级），表明与体内结果具有好的相对相关性。
对于注射性制剂的肌肉刺激性，另一个被建议的体外检测是红细胞溶血检测（Brown等，1989年）。水溶性制剂与新鲜采集的人血以1：2比例轻柔混合5min，然后在波长540nm处测量吸光度，以决定幸存的红细胞的百分数，再将这个值与已知刺激物和非刺激物的值进行比较。对于非常小的一组化合物（4个），这个检测报道可以精确地预测肌肉刺激性。
