13.5基因工程菌的发酵
外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件（如营养、pH、温度、溶氧、比生长速率）息息相关，所以必须优化基因工程菌的培养条件，进一步提高基因表达水平。
13.5.1重组菌的稳定性
基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定现象，即出现一定比例不含质粒的子代菌或外源基因从质粒上丢失的现象。由于这种菌与带质粒的菌相比具有一定的生长优势，因而能在培养中逐渐取代含质粒菌，而成为优势菌，减少基因表达的产率。
为了提高工程菌培养中的稳定性，一般采用两阶段培养法，第一阶段先使菌体生长，然后再诱导外源基因表达，避免目的蛋白积累而过早地抑制细胞的生长。如以PL启动子控制生产干扰素a‐2b，30℃生长8h后升温至42℃诱导表达2h，表达量占细胞蛋白的20％。
此外，在培养基中加入抗生素等选择性压力，以抑制质粒丢失菌的生长，也是提高工程菌培养中质粒稳定性的常用方法。
13.5.2发酵过程优化
发酵的控制包括营养物质、温度、pH、溶氧等的控制，其中营养控制是关键。
13.5.2.1发酵用工程菌株的筛选
将冻存的工程菌在LB固体斜面培养基上活化12h，挑单菌落分别接种于5mlLB液体培养基中，30℃培养至OD600为0.2~0.8，分别取1ml于另一试管中培养3h，收集菌体，测各管的表达量，选表达量高的作为发酵用种子。
13.5.2.2培养基的选用
培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。常用的碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露醇等，常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。哪种培养基配方合适，一般通过试验确定。
13.5.2.3温度
对于采用温度调控基因表达或质粒复制的基因重组菌，发酵过程一般分为生长和表达两个阶段，通常先在较低温度下培养，然后升温，以大量增加质粒拷贝数，诱导外源基因表达。然而在大规模培养中，常因升温过程长而引起比生长速率的下降或质粒的丢失。
温度有时候还影响着蛋白质活性和包涵体的形成。如重组人生长素在30℃培养时是可溶的，在37℃培养时则形成包涵体。另外，降低温度也可以减少重组蛋白的降解。所以在发酵时应综合考虑，设置合适的温度。
13.5.2.4pH
菌体生长和产物合成过程中的pH一般控制在6.8~7.6范围内。如采用两阶段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。
13.5.2.5溶解氧
溶解氧对菌体的生长和产物的生成影响都很大。特别在高密度发酵过程中，由于菌体密度高，发酵液的摄氧量大，需要增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量，也可用空气分离系统来提高通气中氧分压和在菌体中克隆具有提高氧传质能力的VHB蛋白等措施提高溶解氧。此外，还应注意不同菌株对氧的要求是有差别的，在发酵过程中一味追求溶氧水平未必能得到高表达效果。
13.5.2.6分批补料培养
分批培养时，如果采用高浓度的碳源、氮源和盐，就会造成溶液渗透压过高，细胞脱水死亡，往往会抑制菌体的生长，使目的产物得率下降；如果降低培养基中起始营养物质的浓度，则会因缺乏营养补给而造成生长密度有限。现多采用分批补料培养，使各种培养基成分低于抑制浓度。
13.5.2.7诱导时机
工程菌多采用前期菌体生长，后期外源基因表达的分段培养工艺。因此，诱导时机的选择尤为重要。一般在对数生长期或其后期诱导表达。控制好菌体浓度，无论是分批培养还是采用流加工艺，一般都能得到较高的表达量。
13.6基因重组药物的分离纯化
基因重组药物的表达形式不同，所采用的分离纯化方法也不一样。产物的表达形式主要有以下几种：①细胞内不溶性表达———包涵体；②细胞内可溶性表达；③分泌型表达；④细胞周质表达。
包涵体是指某些目的产物以不溶性形式产生并聚集形成的蛋白质聚合物，是基因重组药物在大肠杆菌中特有的表达形式。因为包涵体是不溶性聚集物，所以比较容易分离；但因为表达产物无生物活性，必须经过变性复性，复性时，容易错误折叠。如何高效地复性蛋白是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步，已成为产业化的瓶颈之一。
对于包涵体形式表达的目的蛋白，其分离纯化一般包括：①菌体的收集与破碎；②包涵体的分离、洗涤与溶解；③变性蛋白质的纯化；④重组蛋白质的复性。具体操作见重组人白细胞介素的纯化。
对于细胞内可溶性表达和分泌性表达，在微生物发酵中都是比较常见的。前者收集菌体破碎后，进一步提取、分离纯化；后者除去菌体后，从发酵液中提取、分离纯化。
对于细胞周质表达，先收集菌体，然后将其放在20％蔗糖溶液中保温，使其发生质壁分离，接着快速地用4℃的MgCl2溶液稀释并降温，使细胞外膜突然破裂，或者在高渗溶液中加溶菌酶，破坏细胞壁，释放周质蛋白。
13.7重要重组细胞因子举例
13.7.1白细胞介素
白细胞介素（interleukin，IL）是介导白细胞间相互作用的一类细胞因子。至2009年，人白细胞介素家族已拥有35个成员，分别命名为IL‐1~IL‐35。目前，IL‐2和IL‐11已被成功地开发为基因工程药物，且被批准生产上市；IL‐3、IL‐6、IL‐10、IL‐12和IL‐15等正在研究开发中，有的已进入Ⅱ期临床研究；而IL29~IL35是近几年发现的，对它们的研究刚开始。
13.7.1.1人IL‐2
IL‐2是主要由激活的T细胞或NK细胞产生的一种糖蛋白，其主要生理功能是促进T淋巴细胞的增殖，又称T细胞生长因子。IL‐2具有单向性和下行性的种属特异性。高等动物的IL‐2能作用于低等动物的细胞；反之，则不行。
人IL‐2前体由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时，其信号肽（含20个氨基酸残基）被切除，产生成熟人IL‐2。人IL‐2的单链多肽结构中有3个半胱氨酸（Cys、Cys、Cys），仅在Cys58和Cys105之间形成分子内二硫键才，IL‐2有活性。Cys125的存在易形成二硫键错配，形成二聚体，降低甚至失去IL‐2的活性。将Cys125突变为丝氨酸或丙氨酸后，可改善其活性和稳定性。这种突变体也被批准上市。IL‐2的糖基变化很大，糖基化与否并不影响IL‐2的功能，故可以用大肠杆菌表达体系生产重组人IL‐2。IL‐2对热不稳定，在56℃处理30min后，其生物活性基本丧失，一般加白蛋白作为稳定剂。重组人IL‐2在4℃可保存一年以上，在pH2~9的溶液中保持稳定，冻干制品较为稳定。
临床应用上，IL‐2主要用于肿瘤的治疗，晚期肾癌、恶性黑色素瘤和白血病等疗效较好；此外，还可用于抗感染治疗，某些病毒性、细菌性和细胞内寄生菌等感染；对于先天性和后天性免疫缺陷症也有一定疗效。
13.7.1.2重组人IL‐2的制备
利用大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞都已成功表达了重组人IL‐2，不过大量生产重组人IL‐2主要还是使用大肠杆菌。
（1）人IL‐2cDNA克隆的制备
从一种被激活的人白血病T细胞株中提取高活性的IL‐2mRNA，以此为模板，逆转录单链cDNA，经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA末端连接若干dT残基，以人工合成的寡聚dG为引物，利用DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA，经蔗糖密度梯度离心法分离出此cDNA片段。通过G‐C加尾法将此IL‐2cDNA片段插入到pBR322质粒的PstⅠ位点，用重组质粒转化大肠杆菌，得到IL‐2cDNA文库。利用mRNA杂交实验筛选IL‐2cDNA文库，获得含全长人IL‐2cDNA片段的克隆。
（2）工程菌的构建
从含人IL‐2cDNA片段的克隆中提取重组质粒，用限制性核酸内切酶酶切并分离目的基因，然后将其重组进表达载体，转入大肠杆菌，对筛选的重组体进行目的基因鉴定后，即可作为工程菌。
（3）重组人IL‐2的表达
将重组人IL‐2的大肠杆菌进行三级种子活化，然后以三代种子液：发酵液（1∶10）比例接种，30℃培养4h，快速升温至42℃培养4h，离心收集菌体，—20℃保存。
（4）重组人IL‐2的纯化
重组人IL‐2在E.coli中高水平表达时，以不溶性包涵体形式沉淀在细菌细胞浆中。包涵体主要含IL‐2单体分子聚合而成的多聚体，此外还包括细菌蛋白、质粒DNA、16SrRNA和23SrRNA。rIL‐2在包涵体中以还原状态存在，既无分子内二硫键也无分子间二硫键，不溶于水且无生物活性。
基于rIL‐2的上述性质，利用包涵体和还原型rIL‐2的不溶性，以离心为主要手段，制备高纯度包涵体；再设法使包涵体解聚成单分子，此解聚过程即变性，常用高浓度变性剂6mol/l盐酸胍或8mol/l尿素溶解包涵体，变性后的分子仍无生物活性。在保持rIL‐2处于单体状态的前提下，用1.5μmol/l硫酸铜和0.5mol/l还原型谷胱甘肽GSH复性，也就是恢复二硫键和正常的分子结构，这样就有了生物活性，再进一步活化。
①重组菌的破碎
离心收集rIL‐2工程菌，洗涤几次后，冰浴下进行超声破碎，尽量完全破碎细胞。菌体是否完全破碎可以通过高倍显微镜下观察细胞形态或测定260nm波长的光吸收来确定。
