分子生物学与基因工程是当今生物科学研究中发展最活跃的学科之一。近年来人们在人类基因组计划、功能基因的克隆与分析、重组DNA技术、分子疫苗开发、基因诊断与治疗等领域中取得了许多令人瞩目的成果,分子生物学和基因工程已不单单成为生物学的基础知识,而且已成为生物科学未来发展的优先研究领域与技术,它决定着整个生命科学研究的发展方向。本章节对分子生物学与基因工程的研究现状与发展趋势进行简要的阐述。
一、分子生物学与基因工程的含义及主要研究内容
分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科,它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象,是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。偏重于核酸的分子生物学,主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程,其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会,也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明,从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。
这些生物大分子均具有较大的分子量,由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息,并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统,由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育及代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。
而基因工程是分子生物学的重要内容,也是理论部分的延伸与实践,也叫基因操作、遗传工程,或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中,并使之无性繁殖(称之为“克隆”)和行使正常功能(称之为“表达”),从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来,基因工程专指用生物化学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段)与载体系统(病毒、细菌质粒或噬菌体)的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制,继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子,无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子,或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系,使重组基因在细胞内表达,产生特定的基因产物。
根据分子生物学的定义与含义,其研究内容主要包括以下三个方面:(1)核酸的分子生物学:主要研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息,因此分子遗传学(molecular genetics)是其主要组成部分。由于20世纪50年代以来的迅速发展,该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术,是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译,核酸存储的信息修复与突变,基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则(central dogma)是其理论体系的核心。(2)蛋白质的分子生物学:主要研究执行各种生命功能的主要大分子——蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多,但由于其研究难度较大,与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展,但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。(3)细胞信号转导的分子生物学:主要研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其他各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下,细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化,例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等,从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理,明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系,是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。
二、分子生物学与基因工程的发展历程
根据历史事件及其在分子生物学与基因工程领域中的重要性,分子生物学与基因工程的发展历程可人为地分成以下三个阶段:
(一)准备和酝酿阶段
19世纪后期到20世纪50年代初,是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质认识上的重大突破:
1.确定了蛋白质是生命的主要基础物质
19世纪末,Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精,第一次提出酶(enzyme)的名称,酶是生物催化剂。20世纪20-40年代提纯和结晶了一些酶(包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黄酶、细胞色素C、肌动蛋白等),证明酶的本质是蛋白质。随后陆续发现生命的许多基本现象(物质代谢、能量代谢、消化、呼吸、运动等)都与酶和蛋白质相联系,可以用提纯的酶或蛋白质在体外实验中重复出来。在此期间对蛋白质结构的认识也有较大的进步。1902年,EmilFisher证明蛋白质结构是多肽;40年代末,Sanger创立二硝基氟苯(DNFB)法、Edman发展异硫氰酸苯酯法分析肽链N端氨基酸;1953年,Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子——胰岛素A链和B链的氨基酸全序列分析。由于结晶X-射线衍射分析技术的发展,1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。所以在这一阶段对蛋白质一级结构和空间结构都有了认识。
2.确定了生物遗传的物质基础是DNA
虽然1868年Miescher就发现了核素(nuclein),但是在此后的半个多世纪中并未引起重视。20世纪20-30年代已确认自然界有DNA和RNA两类核酸,并阐明了核苷酸的组成。由于当时对核苷酸和碱基的定量分析不够精确,得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的结果,因而曾长期认为DNA结构只是“四核苷酸”单位的重复,不具有多样性,不能携带更多的信息,当时对携带遗传信息的候选分子更多的是考虑蛋白质。40年代以后实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足的进步。1944年,Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA;1952年,Hershey和Chase用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸,感染大肠杆菌的实验进一步证明了是遗传物质。在对DNA结构的研究上,1949-1952年Furbery等的X-衍射分析阐明了核苷酸并非平面的空间构像,提出了DNA是螺旋结构;1948-1953年,Chargaff等用新的层析和电泳技术分析组成DNA的碱基和核苷酸量,积累了大量的数据,提出了DNA碱基组成A=T、G=C的Chargaff规则,为碱基配对的DNA结构认识打下了基础。
【知识拓展】
英国生物化学家弗雷德·桑格尔(Fred(Frederick)Sanger),1918年8月13日出生,分别获得1958年和1980年诺贝尔化学奖。他是同一领域内两次获奖的第二人,更关键的是,两次获奖理由都可归结为:测序。并且,他是目前唯一在世的两次获得诺贝尔奖的人。
1958:弗雷德·桑格尔发明酶法测定人胰岛素序列,从而确定胰岛素的分子结构,开创了蛋白质测序的领域。
1980:弗雷德·桑格尔、沃尔特·吉尔伯特共同荣获诺贝尔化学奖。他们的贡献在于:分别使用不同的方法测定DNA的序列。Sanger法后来成为主流,并用于人类基因组计划(HGP)的测序。
【知识拓展】
美国化学家莱纳斯·鲍林(Linus Pauling,1901-1994),分别荣获1954年诺贝尔化学奖和1962年诺贝尔和平奖。他是目前为止唯一一个两次单独获得诺贝尔奖的人。
1954:莱纳斯·鲍林独享诺贝尔化学奖。他的贡献在于阐释化学键的本质,并将其应用于解释复杂物质的结构。
1962:莱纳斯·鲍林独享诺贝尔和平奖。他的事迹是,反对核武器实验、核武器扩散、核武器使用。诺贝尔奖委员会评价为:“Linus Carl Pauling,who ever since 1946 has campaigned ceaselessly,not only against nuclear weapons tests,not only against the spread of these armaments,not only against their very use,but against all warfare as a means of solving international conflicts.”
(二)建立和发展阶段
这一阶段是从50年代初到70年代初,以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。DNA双螺旋发现的最深刻意义在于:确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式;从而最后确定了核酸是遗传的物质基础,为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在此期间的主要进展包括:
1.遗传信息传递中心法则的建立
在发现DNA双螺旋结构的同时,Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年Kornberg首先发现DNA聚合酶;1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留复制模型提出了证明;1968年Okazaki(冈畸)提出DNA不连续复制模型;1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物;70年代初获得DNA拓扑异构酶,并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究;这些都逐渐完善了对DNA复制机理的认识。
在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时,提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶;1961年Hall和Spiegelman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补;逐步阐明了RNA转录合成的机理。
在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。50年代初,Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体是细胞内蛋白质合成的部位;1957年,Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设;1961年,Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合;1965年,Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构;特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力下破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码,随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性,从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。
上述重要发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系。1970年,Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶,进一步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。