研究设计、优化分离操作过程对生物工程产品的生产十分重要，合理的、完善的分离操作过程是充分利用所采用分离技术原理的特点、充分发挥分离设备的技术性能的前提，有利于达到提高分离效率、减少分离步骤、获得高质量产品、降低生产成本、提高企业经济效益的目的。
四、生物分离技术的分类
生物分离技术的分类很灵活，可以按被分离物质的性质分类，也可以按分离过程的本质分类。按被分离物质的性质分类，可分为物理分离法、化学分离法、生物学分离法。按分离过程的本质分类，可分为平衡分离过程、差速分离过程和反应分离过程。
1.平衡分离法根据溶质在两相（如气液、气固、液液、液固、气固）间分配平衡的差异实现分离。溶质达到分配平衡的推动力仅取决于系统的热力学性质，即溶质偏离平衡态的浓度差（化学势差）。显然，溶质达到相间分配平衡的过程为扩散传质过程，因此，平衡分离又称扩散分离。蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、沉淀、吸附和离子交换、色谱等均为典型的分离过程。
2.差速分离是利用外力（如压力、重力、离心力、电场力、磁场力）驱动溶质迁移产生的速度差进行分离的方法。传统的过滤、重力沉降和离心沉降等非均相物系的机械分离方法根据溶质大小、形状和密度差进行分离，也属差速分离的范畴。其他典型的差速分离法包括超滤、反渗透、电渗析、电泳等。
3.反应分离是利用外加能量或化学试剂，促进化学反应进行而达到分离的目的。
由于生物分离技术的多样性，分类方法并不局限于上述简单的分类。不同分离原理可以组合构成新的分离技术。在有些情况下，两种分离原理共同发挥作用，促进分离效率的提高。例如，色谱和电泳相结合的色谱电泳和电色谱过程既利用色谱的平衡分离原理，又利用电泳或电渗的电场驱动作用强化分离。因此，分离技术丰富多彩，并不局限于上述简单的分类。不同分离原理的组合可派生新型高效的分离方法，是生物分离工程研究的重要内容。
对于特定的目标产物，要根据其自身的性质以及与其共存杂质的特性，选择合适的分离方法和不同分离方法的组合，以获得最佳分离效果，实现高纯度、高收率和低成本的分离目标。
【知识拓展】
液相层析原理简介
层析分离都具有固定相和流动相，固定相是不动的，流动相对固定相作相对的运动。液相层析技术利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相（液体）推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。
层析技术是生物下游加工过程最重要的纯化技术。常用的液相层析固定相有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、合成高分子凝胶等。按照分离机制的不同，液相层析可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性层析、反相色谱、亲和层析等不同类型。
五、生物分离与纯化的一般过程
由于生物原料带有明显生物物质的特征，因此分离与纯化工艺不能简单地应用化工单元操作。制备一个生物工程产品，往往需要将多步单元操作串联起来，最终得到符合一定质量要求的产品。通常，下游分离过程包括以下几个处理阶段：原料的预处理和固液分离、产物提取、产物纯化（精制）、成品加工。
（一）原料的预处理和固液分离
生物产品的起始分离材料中含有可溶性及不可溶性、大分子与小分子多种成分，生物分离的第一步就是要通过固-液分离，将菌体细胞或不溶性成分从溶液中分离出来，从而得到透明清澈的液体，才能采用各种物理、化学、生物的方法进行产物的进一步分离纯化。
发酵液的预处理也称不溶物的去除，主要采用凝聚和絮凝等技术来加速固相、液相分离，提高过滤速度。过滤和离心是发酵液预处理最基本的单元操作。在这个阶段，要除去与目标产物性质有很大差异的杂质，从复杂的料液中分离出目标产物，将产物浓缩并转移到能保护产物活性的环境中。如果是提取胞内产物，先要把细胞、菌体与发酵液分离，然后破碎细胞，通过离心、过滤等手段去除细胞碎片，收集溶有目标产物的清液。
固液分离所用的单元操作有：①絮凝，在溶液中加入高价无机盐离子或大分子高聚物，利用无机盐离子电荷或高聚物电荷的架桥作用，使得溶液中的不溶物或部分大分子杂质从溶液中沉淀，得到澄清溶液，方便进一步处理。②离心，通过离心作用，将固体粒子或菌体与液体分离，得到澄清溶液。③过滤，由过滤设备将固体粒子截留，而得到澄清溶液。④微孔过滤，利用微孔滤膜或微孔过滤器将一定大小粒子或菌体（0.2微米）以上滤除，得到澄清溶液。⑤细胞破碎技术，细胞内产物的分离，需要破碎细胞、释放目的产物。细胞破碎技术包括机械破碎（珠磨、高压匀浆机、超声波等）和化学破碎（调pH值、化学试剂处理、溶菌酶）等。
（二）产物提取，也称为目标产物的初步分离纯化
通过这一阶段的操作，将目标物和与其性质有较大差异的杂质分开，使产物的浓度有大幅度的提高，显著缩小物料体积，为纯化操作创造有利条件。这是一个多单元协同操作的结果，可采用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作。
所用方法：①盐析法，在蛋白质溶液中加入高浓度的无机盐（如硫酸铵或氯化钠等），使蛋白质从溶液中析出。此方法用于体积不太大的场合，若体积过大，无机盐加入量必然很大，将造成环境问题。②有机溶剂沉淀，蛋白质溶液加入一定比例的有机溶剂（乙醇、丙酮等），溶液极性发生变化导致蛋白质从溶液中析出。操作中要注意低温下操作（10℃以下），否则，会引起蛋白质变性失活。③化学沉淀，蛋白质溶液中加入某些沉淀剂（钙离子、锌离子、大分子电解质聚合物），引起蛋白质沉淀。④吸附，用人工合成的多孔性高聚物微球，从溶液中吸附目的分子，然后用洗脱剂进行洗脱，得到目的产物的溶液。许多抗生素、氨基酸、天然植物成分均可用大孔吸附剂分离。⑤膜分离技术，利用人工合成的高聚物膜上的孔道特征将溶液中不同分子量的成分进行筛分的技术。膜技术包括微滤、超滤、纳米过滤、反渗透、渗透蒸发等。⑥萃取，萃取是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。按其原理不同，可分为有机溶剂萃取、液固萃取、双水相萃取、液膜萃取、反胶团萃取、超临界萃取等。
（三）精制也称为目标产物的高度纯化，即利用各种方法将具有一定纯度的生物产品进一步纯化至高纯度状态
其目的是去除与目的产物的物理化学性质比较接近的杂质。在这个过程中通常采用对产物有高度选择性的技术，能够有效完成这一生物分离过程的技术首选色谱分离技术。目前这一阶段的单元操作涉及的色谱分离技术有凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水性相互作用色谱、亲和色谱等。
①凝胶过滤层析，利用凝胶过滤介质为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化以及生物大分子溶液的脱盐。
②离子交换层析，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。利用多孔离子交换树脂上所带的电性基团吸附溶液中的带相反电荷的生物分子，然后用洗脱剂进行解析处理，得到洗脱液。许多抗生素、氨基酸、有机酸、天然植物带正电荷或负电荷成分均可用离子交换树脂吸附法进行分离。离子交换层析是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要分离纯化手段。
③疏水性相互作用色谱，利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的一种色谱法。
④亲和层析，利用生物体内各种特异相互作用的分子对（抗原-抗体、激素-受体、凝集素-糖蛋白、酶-底物或抑制剂等）设计的分离方法，是利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术。将亲和体系中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性吸附或结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。如通过化学固定化技术将酶抑制剂固定到载体介质上，就可从生物材料中分离某种酶。
（四）成品加工
经过上述三个阶段的分离纯化，已经获得了所要的生物产品，但它还不是商用成品，还要根据产品的用途、质量要求进行最后的加工，来提高浓度，或制成晶体状或粉状固体。这一阶段的单元操作有浓缩、结晶与干燥。结晶是从液相或气相生成形状一定、分子（或原子、离子）有规则排列的晶体的现象。对热比较稳定的成分的干燥可以用喷雾干燥、气流干燥等方法；对于蛋白质类热不稳定成分可用真空冷冻干燥，在低温冷冻条件下除去水分，得到冻干品。
上述四个步骤和其包含的单元操作是生物分离过程的基本程序，生物产品种类繁多，每一个具体目标物都有自己特定的分离纯化过程，具体分离制备过程可以参考相关手册和资料。
【知识拓展】
基因工程人胰岛素生产过程
人胰岛素可以利用基因工程大肠杆菌生产，但产品的浓度很低，而且细菌只能产生胰岛素前体，需要对其进行化学裂解以获得人胰岛素产品。人胰岛素是一种注射用治疗试剂，成品的纯度至关重要，凡是可能对人体造成危害的细胞杂质都应该完全去除。
人胰岛素在细菌内以包含体形式存在，包含体形成袋状物并与细胞质中其他组分彼此隔离，其内部富含胰岛素。因此需要进行细胞破碎以释放包含体，进而得到人胰岛素，使之进入水溶液中。加入溴化氰裂解胰岛素前体，形成A链和B链，然后透析改变溶液的pH值，引入新的缓冲溶液，并且去除裂解试剂。在提取出多肽并经磺化反应后，进行A链和B链的分离。这些纯化步骤包含沉淀和一个色谱步骤。对于A链所在的上清液，其中的杂质组分在pH5条件下沉淀，接着进行弱阴离子交换色谱处理，最后进行高效反相液相色谱（HPLC）分离。包含B链的透析液经过沉淀、阴离子交换色谱和凝胶过滤层析等处理得到成品。
【知识拓展】
狂犬疫苗生产的下游加工过程
病毒疫苗的生产可采用动物体、单细胞培养和悬浮培养等方法，在宿主细胞分泌病毒或者病毒裂解细胞之后获得疫苗蛋白。狂犬疫苗生产工艺如下：
1.采用微载体培养技术用猿猴细胞生产狂犬疫苗，每批生产规模可达几百升。
2.猿猴细胞固定在微载体颗粒上，病毒感染细胞并进行复制。
3.利用一系列超滤膜组件分离微载体颗粒和病毒。
4.采用化学法灭活狂犬疫苗：低温下用β-丙内酯灭活；再升温使β-丙内酯水解。
5.采用区带离心分离去除非抗原性物质，以减少产品的副作用。
6.在疫苗制剂中加入白蛋白作为稳定剂。
六、生物分离纯化工艺设计前应了解的信息
（一）在设计前，首先要掌握产物的物化性质，包括：
①溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等。
②分子量和分子形状。对于高分子物质的分离非常有意义。
③沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质的分离非常有意义。
④极性大小。
⑤分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等。
⑥功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据。
⑦免疫原性。为亲和色谱的设计提供依据。
⑧稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等（如青霉素低pH不稳定）。
⑨分子的浓度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等。
⑩等电点。
（二）成品规格（或产品质量标准）
不同技术规格的产品，分离纯化过程的方案差别很大，设计产品分离方案前要了解成品的规格（或产品质量标准）。产品技术规格包括纯度要求、活性要求、物理特性、卫生指标等，分离纯化的过程应与之相适应。如下表为五肽胃泌素的上海市药品标准。
（三）进料的组成和物性，包括：
①目的产物的浓度高低。
②物料中与目的产物相近物质的物理化学性质。
③目的产物的定位是胞内还是胞外。
④菌种的种类和形态。
⑤微生物的含量和发酵液的黏度。
（四）生产规模
不同的单元操作适合于不同的生产规模。比如冷冻干燥只适合小批量生产，而大规模生产需要干燥时，就应采用真空干燥或喷雾干燥。另外，透析脱盐过程只适用于实验室小规模的物质处理。所以，要综合考虑规模效应。
（五）分批分离还是连续纯化
有些单元操作适用于分批生产，有些则能够连续运行，若要适应上游发酵过程分批或连续的操作方式，分离纯化过程的单元操作必须改进。
（六）对环境的危害性
设计工艺过程时，要充分注意废物的排放和危险生物物质的处理，避免污染环境。这些废物和危险物质包括：
①发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。
②目的产物本身的危害性。抗肿瘤代谢类药物、抗生素、激素类药物等。
③试剂危害。萃取试剂四氯化碳、甲苯、苯、二甲苯。
④微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。
