1.2.1红细胞保存液（阿氏液）的配制：取氯化钠4.2g，枸橼酸钠8.0g，枸橼酸0.55g，葡萄糖20.5g，加无离子水至1000ml，经121℃高压灭菌15min，置4℃保存备用。
1.2.2血凝素（病毒抗原）稀释液（0.4％pH9.0BABS）的配制：因血凝素的不同，所需稀释液也不相同。如新城疫血凝素用生理盐水，而流乙脑炎血凝素则需用0.4％pH9.0BABS稀释液。
A.O.4％pH9.0BABS母液的配制
0.5mol/L硼酸溶液：硼酸30g，加无离子水至1000ml，溶解后备用；
1.0mol/L氢氧化钠溶液：氢氧化钠40g，加无离子水至1000ml，溶解置3d后使用；
1.6mol/L氯化钠溶液：氯化钠87.7g，加无离子水至1000ml经121℃高压灭菌15min后置4℃备用。
B.硼酸氢氧化钠盐溶液（pH9.0BHS）的配制：取0.5mol/L硼酸溶液100ml，
1.0mol/L氢氧化钠溶液24ml，1.6mol/L氯化钠溶液80ml，加无离子水至1000ml，充分混匀后调pH至9.0。
C.0.4％pH9.0BABS使用液的配制（现用现配）：取pH9.0BHS液100ml，牛血清白蛋白0.4g，充分溶解后使用。
1.2.325％白陶土溶液的配制：取白陶土25g置离心瓶中，加适量1M盐酸溶液混匀，2000r/min离心10min，弃上清液，再加1N盐酸溶液搅匀，如上离心洗涤3次。沉淀白陶土用0.85％生理盐水或PBSl00ml配成25％溶液（呈糊状），然后用5M的氢氧化钠溶液调整pH至7.2，121℃高压灭菌后，置4℃保存备用，保存期不得超过4个月。
1.2.4不同pH的红细胞稀释液的配制：不同病毒对稀释红细胞用缓冲液的pH均有不同要求，如流乙脑炎病毒要求红细胞在pH5.8～6.6的PBS液中才能凝集。因此每次试验必须根据对象病毒而选择缓冲液适当的pH。
母液的配制
甲液：磷酸二氢钠（Na2H2PO4·12H20）35.8g，氯化钠4.4g，加无离子水至500ml，
经121℃高压灭菌15min后置4℃保存备用。
乙液：磷酸氢二钠（Na2HP04·2H20）15.6g，氯化钠4.4g，加无离子水至500ml，
121℃高压灭菌15rain，置4℃保存备用。
1.3霍乱弧菌滤液的制备：将稻叶型霍乱弧菌接种于牛肉汤（新鲜牛肉浸汁液100ml，氯化钠0.5g，蛋白胨2g，调pH至6.9，分装试管，每管8～10ml，121℃20min高压灭菌，37℃培养12h），取此培养液接种于牛肉汤琼脂（在牛肉汤基础上多含1％琼脂），每平皿3滴，用L形玻棒于琼脂面上转匀，置37℃培养12h（琼脂面向上，勿倒置）取出，选无污染生长好的平皿，用L形玻棒去掉面上菌苔，将琼脂部分移到有两层纱布的漏斗中，漏斗下有三角瓶。用长镊子将琼脂中的水分挤出。将此液经4000r/min离心15min，取上清用蔡氏滤器EK滤板除菌。滤液经杂检确认无菌后向滤液中加入硫柳汞达万分之一，保存于4℃冰箱备用。操作时注意无菌、安全。
1.4血凝素：痘类病毒的血凝素是与病毒颗粒分开的，而其他绝大多数的血凝素是与病毒颗粒相关联的。因此，血凝素的获得通常将病毒感染鸡的尿囊液或细胞培养液或用生理盐水稀释患病动物的粪便或脏器匀浆等经离心沉淀取得的上清液均可做血凝素。如流感病毒、新城疫病毒等通常用收获的感染鸡胚的尿囊液经3000r/min离心15min，取上清液即为血凝素，乙脑病毒是从人工感染的鼠脑中提取血凝素，猪血凝性脑炎病毒可用细胞培养的离心上清液做凝集素，犬细小病毒和犊牛腹泻冠状病毒均可用患畜的粪便，用生理盐水稀释（1：10），兔出血症病毒通常用病死兔肝1：10匀浆后离心的上清液也可用于血凝试验做血凝素。
1.5红细胞悬液：根据病毒血凝特性选用适宜红细胞。如流感病毒、新城疫病毒等黏病毒和副黏病毒通常用鸡红细胞，乙脑病毒用鹅红细胞，细小病毒用猪红细胞，冠状病毒用小鼠红细胞，兔出血症病毒用人红细胞。采血时按常规尽量做到洁净无菌纱布过滤至离心管内，2000r/min离心5min，弃上清液，加5～10倍生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心5min，最后一次2000r/min离心10min，弃上清，取沉积红细胞，用适宜pH的PBS液配成1％红细胞悬液。
2.血凝试验试验可在5×10大孔塑料板或96孔微量滴定板上进行，大孔板的操作方法如下。
2.1血凝素效价测定
各孔加生理盐水0.25ml。吸取血凝素0.25ml加于第1孔，混合3次后吸0.25ml加于第2孔，依次倍比稀释至第9孔，弃0.25ml，第10孔不加血凝素，作为生理盐水对照。然后每孔各加1％红细胞悬液0.25ml，混匀后，放置室温，经30、45和60min各观察结果一次。
试验也可用微量法进行，其操作步骤同大孔塑料板法，但用标准滴管稀释，每种成分25ul全量为75ul。
2.2结果判定：以血凝素出现“++”以上最大稀释度为该血凝素的血凝价。
附：判定标准
++++：红细胞凝集成颗粒，细胞周围液体清晰；
+++：红细胞凝集成颗粒，但比上者小，周围液体清晰；
++：红细胞凝集成颗粒，周围液体稍有混浊；
+：红细胞呈小颗粒状凝集，周围液体混浊；
-：红细胞不凝集，成均质状态，下沉于塑料板底部。
3.血凝抑制试验
3.14个单位血凝素的制备：依血凝试验滴定的血凝价，按血凝价乘1/4，即为4个单位血凝素的稀释度，如血凝价为512，则512×1/4=128即为4个单位。
3.2被检血清的处理：因被检血清常常含有非特异性血凝物质和血凝抑制物质，故试验前需对待检血清作适当处理，非特异性血凝物质通常用红细胞吸收法，而非特异性血凝抑制物质一般用胰酶或过碘酸钾处理，也可用白陶土吸收。
3.2.1红细胞吸收法：取0.1ml被检血清加0.4ml 2％红细胞悬液，37℃作用30min后，离心去除红细胞，即成5×稀释血清。
3.2.2胰酶处理法：取0.2ml血清，加入0.2ml 0.4％胰酶，56℃作用30min，再加0.8ml生理盐水，即成1：5稀释的血清。
3.2.3白陶土吸收法：取0.1ml受检血清加25％白陶土溶液0.4ml，振摇混匀，置37℃作用30min，离心除去白陶土即成1：5稀释血清。
3.2.4霍乱弧菌滤液处理：1份血清加4份霍乱弧菌滤液，37℃水浴过夜，再用56℃水浴加热50min，经处理的血清最终稀释度为l：5。
用于新城疫血凝抑制试验的血清不必进行上述处理。
3.3试验方法
按表7－3将被检血清在5×10大孔板上进行倍比稀释，每份血清用1～8孔，第1孔的稀释倍数应为1：5，如血清未经处理，则于第1孔先加0.4ml生理盐水然后加人0.1ml被检血清混合成1：5稀释，随后依次作倍比稀释，再依次加入4个单位血凝素和1％红细胞悬液各0.25ml，第9孔不加血清为血凝素对照，第10孔不加血清和血凝素为盐水对照。
微量血凝抑制试验操作程序与5×10大板法相同，各孔以滴计量（约25ul），未经处理血清，第1孔为1滴血清加1滴生理盐水，起始稀释为2×，稀释至第10孔为1024×。11、12孔为血凝素，盐水对照。
另取一试验板或利用上述试验中剩余一排孔按稀释作血凝素效价校正。
3.4结果判定
以能完全抑制的血清最大稀释倍数为该血清的血凝抑制价，从血凝抑制试验操作术式表可见其血凝抑制价为80×。但尚需与血凝素校正试验的结果比较或许相应提高或降低该血清的血凝抑制价。如果1单位和0.5单位血凝结果为++++和++时，表明血凝素抗原用量高了一个滴度，则该血凝价亦应提高一个滴度，为160×。反之，如1单位和O.5单位为+、-时，则表明血凝素低了一个滴度，血凝抑制价也应下降一个滴度，应为40×。
4.血凝和血凝抑制试验的应用直接血凝试验主要用于血库中红细胞抗原的分型、病毒抗原的鉴定等。血凝抑制试验主要用来测定血清中抗体的滴度、病毒的鉴定、监测病毒抗原的变异、流行病学调查、动物群体疫情的监测等。
5.影响血凝和血凝抑制试验的因素实验室使用的玻璃器材及血凝板均要洁净，一旦出现红细胞变色和污染就不得使用；红细胞有动物的种类及个体差异，因此同批实验应使用同批红细胞，病毒及其血凝素如保存不当，或者反复多次冻融也会影响试验结果；血清中非特异性抑制因子会影响实验结果，故试验前一定要用白陶土或胰酶等处理。血清在加温或保存过程中一旦出现沉淀也容易引起非特异性凝集，这可用红细胞吸收或通过离心来除去；如滴定双血清，抗原分析或比较动物群体抗体水平时应安排在同一次试验进行，各参与要素和器具都应使用同一批次，以免材料的不同而影响实验结果；判定结果一定要在规定的时间观察，每次试验应在一定的温度下进行，如流感病毒在37℃时会从细胞表面释放出来，因此，炎热的夏天最好在4℃下观察结果；试验时加量要准确，才能保证实验结果的正确性和重复性。
三、间接血凝试验和反向间接血凝试验
凝集反应中抗体球蛋白分子与其特异的抗原相遇时，在一定的条件下，便可形成抗原抗体的复合物，由于这种复合物分子很小，如果抗原抗体的含量过少时，形不成肉眼可见的凝集。若设法将抗原结合或吸附到比其体积大千万倍的红细胞表面上，就大大地提高了凝集的敏感性。于是人们将红细胞经过鞣酸或其他偶联剂处理后，使得多糖抗原或蛋白质抗原被红细胞表面的受体结合或吸附，这种被抗原致敏的红细胞与相应的抗体相遇，经过一定时间后出现的血凝现象称为间接血凝反应。同样，如果抗球蛋白致敏红细胞上，也能与相应的抗原在一定的条件下起凝集反应，这称为反向间接血凝试验。当在与致敏红细胞的抗原相应的抗体液中，先加人相应的特异性抗原，在一定的条件下，经过一定的时间后再加入这种抗原致敏的红细胞，由于抗原先和特异性抗体结合，这种抗原致敏的红细胞就不能与抗体起反应，呈现血凝抑制现象，这叫间接血凝抑制试验。
一般抗原致敏红细胞比较容易，而用抗体致敏红细胞比较困难，主要原因是抗血清中蛋白质的成分很复杂，其中除了具有抗体活性的免疫球蛋白之外，还有非抗体活性的免疫球蛋白，这两种免疫球蛋白很难使之分开，而且这两种免疫球蛋白均能同时结合或吸附在红细胞表面，一旦非抗体活性免疫球蛋白在红细胞表面达到一定数量时，致敏的红细胞就不能再与相应的抗原形成可见的凝集。因此，一般实验室均用抗原来致敏红细胞。
1.材料准备和处理
1.1器材：微量振荡器，25ul连续加液器和25ul移液器等实验室常用器械。
1.2红细胞悬液：很多动物的红细胞，如绵羊、家兔、鸡、鸽子、马、猴子及人的O型血都可用作为间接血凝试验的红细胞载体，实验室多选用绵羊红细胞。选择健康的绵羊，自颈静脉无菌采血，将其注入盛有4倍绵羊血量的阿氏液的三角烧瓶内，不时摇动3～5min，置4℃过液，次日将保存在阿氏液内的红细胞液经灭菌纱布过滤后用生理盐水洗3～4次，每次2000r/min离心5min，最后一次2000r/min离心10min，用生理盐水配成0.5％～1％的红细胞悬液，4℃保存，备用期一周。
1.3红细胞的醛化：醛化原则：无论是致敏的或末致敏的新鲜红细胞保存期很短，临时致敏也不方便，且不同批次或不同动物个体的差异，造成对系统研究工作前后结果不一，影响诊断，故目前都采用醛化红细胞。醛化的方法随醛种类的不同（有甲醛、戊二醛及丙酮醛）而异，但醛化的原则是一样的，如醛化之前必须充分洗涤红细胞，除净红细胞表面的血浆蛋白；加醛固定过程中红细胞最终浓度为10％；开始加入浓度不宜过浓；醛化作用温度要低，否则红细胞容易变异，在整个醛化过程中要不时地振摇，使醛类与红细胞充分均匀地接触。目前国内都采用戊二醛，因为戊二醛醛化过程简单，在短时期即可完成，且致敏的效果也比较好。
醛化方法：红细胞用0.15mol/L的pH7.2的PBS液配成4％的悬液，在冰浴的条件下加入2.5％的戊二醛，边加边摇，使最终浓度为0.4％（即100m14％的红细胞悬液内加入16m12.5％的戊二醛），在4℃固定1h，摇匀后用生理盐水洗涤4～5次，最后用生理盐水配成10％的红细胞悬液。加1：10000（终浓度）NaN3，4℃保存备用。
