用标准滴管吸取上述稀释补体于96孔微量板上第1—9孔，每孔2滴，然后加入已知阴性抗原和2×标准阴性血清每孔分别各1滴，置4℃冰箱过夜，次日取出，每孔加致敏红细胞悬液2滴，振摇后，置37℃水浴30min，观察结果，若测得的结果，则此补体效价在第五孔，即相当于补体稀释的第五管。
以后进行正式试验时，要用几个不同的补体量（多于1个效价及少于1个效价的），补体量足以全溶、部分溶和不溶的几个孔，如上例3—9孔，即补体稀释的3—9管。
2.3标准比色管的制备：为了提高判定的正确性，需先配制标准比色管，分别滴入微量板的1-11孔，每孔6滴作为标准。各试验孔溶血程度与标准对比后，记录溶血值。制备标准比色管时，需先配制红细胞溶血液和3倍稀释的致敏红细胞悬液。取致敏了的4%红细胞悬液2ml加蒸蒸水6ml，冻融数次使红细胞完全裂解即为红细胞溶血液。取2ml致敏了的4%红细胞悬液加6mlGVB淮，再加甲醛2滴以防溶血，即为3倍稀释的致敏红细胞悬液。
2.4抗原效价滴定：用阳性抗原和阴性对照抗原分别与标准阳性血清和GVB液作用，以9个不同稀释度的补体按表7-20作抗原效价滴定
3.正式试验试验在96孔微量板上进行，将被检血清作2×或5×稀释后，灭活，每一检样做二列，每列做7个孔，1～7孔的补体稀释度同补体稀释方法的3～9管。
在进行正式试验时应设阳性血清和阴性血清对照，阳性血清对照的效价（阳性抗原与对照抗原的差）应在5.0以上，阴性血清对照应为0。以第一列的溶血值的和减去第二列溶血值的和，即为该被检血清的效价，效价在0.8以上者判为阳性，在0.2以下者判为阴性。介于0.3—0.7者为疑似，应进行重试，重试后仍在0.3以上者判为阳性，在0.2以下者判为阴性。
第五节标记类试验
一、免疫酶技术
免疫酶技术是继免疫荧光技术和放射免疫测定技术之后发展起来的又一种免疫标记技术。
原理免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合，以酶作标记物，酶对底物具有高效催化作用的原理而建立的。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的。
分类免疫酶技术在方法上分为两类，一类用于组织细胞中的抗原或抗体成分检测出和定位，称为免疫酶组织化学法或免疫酶染色法；另一类用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分，称为免疫酶测定法。
1.免疫酶染色法标本制备后，先将内源酶抑制，然后便可进行免疫酶染色检查。其基本原理和方法与荧光抗体法相同，只是以酶代替荧光素作为标记物，并以底物产生有色产物为标志。免疫过氧化物酶试验是免疫酶染色法中最常用的一种。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。
1.1直接法：用酶标记特异性抗体，直接检测微生物或其抗原。在含有微生物或其抗原的标本固定后，消除其中的内源性酶，用酶标记的抗体直接处理，使标本中的抗原与酶标抗体结合，然后加底物显色，进行镜检。
1.2间接法：将含有微生物或其抗原的组织或细胞标本，用特异性抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的部分，再用酶标记的抗抗体进行处理，使其形成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物，最后滴加底物显色，进行镜检。
间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范围广。因为只要用一种酶标记一种动物的球蛋白抗体，就可以检测该种动物的任何一种抗体。此外，酶标记第二抗体可用葡萄球菌A蛋白SPA或生物素与亲合素系统等代替，亦成功地用于许多抗原和抗体的检测。同时，在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性。免疫酶染色法已在动物检疫中广泛应用。
2.免疫酶测定法免疫酶测定法分固相免疫酶测定法和均相免疫酶测定法两类。
固相免疫酶测定法是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。酶联免疫吸附试验（ELISA）是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种。
均相免疫测定法不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需载体，直接从溶液中测定结果。本法主要用于激素、抗生素等小分子半抗原的检测，微生物学上不常应用。本节将重点介绍免疫酶染色法。
酶结合物的制备与纯化在免疫酶技术中，能否制备高质量的酶结合物是试验成败的关键。为获得高质量的酶标记抗体，首先要有纯度高、活性强的酶和抗体。高质量的抗体可通过提取纯化获得。目前，应用最广泛的是辣根过氧化物酶。其次有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D半乳糖苷酶等。用于抗体和抗原标记的酶应无毒性、分子量小、特异性和纯度高、活性强、稳定，且易结合抗体或抗原而不明显影响彼此的活性。
辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP），是从植物辣根中提取的一种过氧化物酶。它是由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉构成的一种糖蛋白，含有多种同功酶，分子量约为40000，等电点在pH5.5-9.0之间。该酶在pH5-10，50℃以下最稳定，在稀溶液中易失活，在-80℃保存最佳。氰化物、重氮化合物、氟化物和硫化物等对之有抑制作用。由于铁卟啉为HRP的活性基团，在403nm波长下呈现最大的光吸收，而与酶反应无关的其他蛋白质，在275nm波长下出现一个光吸收峰，因此可用其光密度的比值来表示酶的纯度。通常用德文（Reinhoit Zahl）的缩写字母RZ表示。即酶的纯度RZ=OD403nm／OD275nm，RZ越大，酶的纯度越高；RZ越小，酶的纯度越低。高质量酶的RZ应该大于3，RZ值在2.5
以上方可使用。
酶标记抗体的制备方法很多，目前应用最广泛的有戊二醛法和过碘酸钠法。
1.改良过碘酸钠法将5mgHRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新配制的0.06mol/LNaIO4水溶液0.5ml，混匀置冰箱30min，取出加入0.16mol/L乙醇水溶液0.5ml，室温放置30min后加入含5mg纯化抗体的水溶液（或PBS）lml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L，pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6h（或过夜）使之结合，然后加NaBH4溶液（5mg/m1）0.2ml，置冰箱2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min；离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L pH7.4PBS中，并对之透析过夜。次日再离心除去不溶物，即得酶-抗体结合物。加0.02mol/L pH 7.4PBS至5ml，测定后，冷冻干燥或低温保存。
2.戊二醛一步法在1.0ml含5mg免疫球蛋白的0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液（PB）中，加入12ml HRP。缓慢搅拌并逐滴加入1％戊二醛溶液0.05ml。室温下继续搅拌2h或放置3h，然后搅拌并滴加等量100%饱和硫酸铵，于4℃冰箱中静止60min，3000r／min离心沉淀30min。将沉淀物用50％饱和度硫酸铵洗涤2次，再将沉淀物溶于少量0.02mol/LpH7.4PBS中，再于4℃冰箱中透析24h，中间换液3次，最后测OD403nm和OD280nm，计算出结合物的酶含量，IgG量以及其克分子比值。
3.戊二醛二步法取HRP 5mg溶于pH9.5、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液（CBS）中，滴入25％戊二醛0.1ml混匀，37℃水浴2h。取出后加220g／L NaCl 0.1ml，充分混匀后置4℃冰箱内10min预冷。将遇冷至4℃的无水乙醇2.4ml，于塑料离心管内颠倒混匀后立即1000r/min离心lOmin，弃其上清液，将沉淀用冷至4℃的80％乙醇洗1次，将离心管倒置，使乙醇流尽（必要时用滤纸拭去）。用PBS 0.5ml溶解沉淀物，加入待标记的抗体溶液0.5ml（含IgG 5-10mg）混合后4℃过夜，加入适量中性甘油后分装，-20℃保存。
4.结合物中HRP与抗体量的测定用分光光度计上分别于280nm和403nm波长测定酶标结合物的光密度（OD），并计算出OD4.3与OD280之比值以及HRP与抗体的摩尔比。
结合物中HRP浓度（mg/m1）=OD280×0.4
结合物中IgG浓度（mg/m1）=（OD280-OD430）×0.3×0.62
酶／抗体摩尔比=HRP浓度/IgG浓度×4
5.结合物稀释度的测定用酶结合物中与抗体相应的抗原直接包被聚苯乙烯反应板，采用ELISA直接法测定酶结合物效价，通常本法制备的酶结合物作1：lO 000稀释时。其OD490仍在1.0以上。
免疫酶染色法的操作程序（以间接法为例）；
1.染色标本的制备用于免疫酶染色的标本有组织切片（冰冻切片、石蜡切片）、组织乳剂涂片、组织压印片以及组织培养单层细胞标本等。这些标本的制备方法与免疫荧光技术相同。
2.标本的固定选用的固定剂应既不影响抗原的活性，又不妨碍抗体的进入，有利于抗原和抗体的结合。微生物抗原的固定剂一般应用甲醇、乙醇和丙酮，以冷条件下的固定为宜，固定时间为10—15min。
3.标本内源酶的消除用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于有些组织和细胞内含有内源性过氧化物酶，可与标记的过氧化物酶在显色反应上发生混淆，因此必须在滴加酶结合物之前，消除内源性酶。即可用0.3％—3％的过氧化氢室温处理标本15—30min，用0.1%苯肼37℃作用lh，或用0.074％盐酸乙醇液（100ml乙醇中含0.2m1浓盐酸）。室温处理15min，再移入PBS和生理盐水中处理15min，另外，还可用1％—3％H2O2甲醇处理单层细胞标本和组织乳剂涂片标本，同时起到固定和消除内源酶的作用。
4.消除标本的背景染色在免疫酶染色法中，消除背景染色是一个关键问题。背景染色有时母特异的，如病变组织的炎性浸润、组织坏死和自溶等，都可引起抗原扩散和移位，造成背景染色。然而，大量的是非特异性背景染色，主要是由于组织成分对免疫球蛋白的非特异性作用。消除的办法最好用与酶标记的同种动物的血清二抗体做预处理。如是切片标本可以3％H2O2作用后，再用10％卵白蛋白作用30min，还可用保温液即O.05％吐温-20和含O.1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS对细胞标本进行预处理可以达到消除背景染色的目的。
5.感作滴加最适浓度的抗血清，在湿盒内37℃30min，使其形成抗原抗体复合物。
6.标记用pH7.4的PBS充分泡洗标本后，滴加最适浓度的酶标记抗IgG抗体使其形成抗原-抗体-抗IgG抗体—酶复合物。
7.加底物用PBS充分泡洗后，加3，3-二氨基联苯二胺（DAB）-H2O2底物溶液，避光显色15-30min。
8.检查冲洗吹干肉眼观察或借助普通光学显微镜检查，抗原所在部位呈现棕黄色。
在上述染色过程中，第一抗体和酶标记第二抗体的最佳使用浓度应以棋盘滴定预先选择，不宜过低或过高，过低会影响检出敏感性，过高则呈现非特异性染色。
注意事项
1.检验时应取健康组织用同法染色作对照，观察其是否出现非特异性反应。
2.标本片用PBS代替酶标抗体染色，观察其内源性酶是否被抑制。
3.免疫酶染色法也可应用间接法、PPA（即酶标SPA）法等。
二、免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
原理 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成有特异性结合物而发出的荧光。
