2.2标本的固定：在荧光抗体试验中，染色标本的固定是个很重要的一步，其目的是防止标本脱落，除去类脂以利抗原、抗体结合和降低本底荧光。固定剂的选择和固定条件应根据被检对象而定。最常用的固定剂是丙酮和75%乙醇，其次是甲醇、甲醛、戊二醛等。固定的温度和时间按固定效果而定。一般用37℃10min，室温15min或4℃30min。某些病毒最好以冷丙酮-20℃固定60min。固定后应随即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。
2.3染色
2.3.1直接染色法：于固定后干燥的标本片上滴加适量工作浓度的荧光抗体，置湿盒内，37℃感作30min后取出。先以pH7.2PBS冲洗，继以自来水冲洗5min左右，最后以蒸馏水冲洗，自然干燥或吹干。滴加缓冲甘油封片（无荧光甘油9份，pH7.2PBS 1份）镜检。
对照的设立
自发荧光对照：已知抗原标本加1-2滴PBS或不加，应无荧光出现。
抗原对照：已知抗原加正常同种动物标记球蛋白溶液染色，应无荧光。
阻抑试验：标本滴加同种未标记抗体感作30min后，再加标记抗体，镜检应无荧光现象。
种属抗原染色：标记抗体与种属抗原标本染色，应无荧光出现。
阳性对照：标记抗体与已知抗原染色，应呈强荧光反应。
对照染色可根据条件适当选择。
2.3.2间接法染色：标本经固定后，于被检标本上滴加已知未标记的抗体（或抗原）置湿盒37℃感作30min；先以pH7.2PBS冲洗，然后浸泡于3min并注意振荡；弃掉PBS，用吸水纸吸干；滴加相应的抗球蛋白荧光抗体，置湿盒37℃感作30min；以上以PBS浸洗3次，最后用蒸馏水洗1次，缓冲甘油封片后镜检。
对照染色，被检标本加抗球蛋白荧光抗体，应无荧光出现；标本先以相应正常动物的血清处理30min，水洗后再以抗球蛋白抗体染色，应无荧光出现；阳性对照 已知阳性标本加相应的特异性免疫血清，然后再以抗球蛋白荧光抗体染色，应出现特异的明亮荧光。
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）
自从1971年Engvall和Perlman首次报道建立酶联免疫吸附试验（enzvme－linked immunosorbent assays，ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高妨碍了其应用，但随着制备包被抗体上采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验的应用。大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，使其成为最广泛应用的检测方法之一。目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。如猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。
1.基本原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
2.用于标记的酶用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性、在室温下稳定、反应产物易于显现、能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
2.1辣根过氧化物酶（HRP）：过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），它是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18％），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH3～9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50％饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。而酶的纯度可用光密度的比值表示，通常用德文（Reinhoit Zahl）的缩写字母RZ表示，即酶的纯度RZ=OD403nm／OD275nm，RZ越大纯度越高，RZ越小纯度越低。纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占75％，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：①邻苯二胺（O-phenylendiamine，OPD）。产物为橙色、可溶性、敏感性高、最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变，是目前国内ELISA中最常用的一种；②联大茴香胺（O-diarnisidine，OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；③5-氨基水杨酸（5-Amino-Salicyticacid，5-AS），产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；④邻联甲苯胺（o-T0luidine，OT），产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。
2.2碱性磷酸酶：系从小牛肠黏膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶性，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pHlO反应系统中，37℃lmin 水解1um磷酸苯二钠为一个单位。碱性磷酸酶的国内产品系从猪小肠黏膜提取制成，其特异性酶活性在20000单位／mg左右。
3.抗体的酶标记方法及标记效果测定
3.1标记方法：良好的酶结合物取决于两个条件，即高效价的免疫抗体和高活性酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需用纯度高、效价高与抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，目前多以戊二醛为交联剂，其次也可用二硝基氟苯加过碘酸钠。以HRP标记抗体为例记述标记程序。
3.1.1戊二醛一步法（AVrameaS氏法）：将5mg HRP（RZ=3.0，活性单位200
U/ug球蛋白）溶于0.5ml PBS（pH7.2）抗体溶液中（含IgG2.0mg），于4℃下对PBS透析过夜。透析后用PBS补足体积达1.25ml，加入10ul 25％戊二醛溶液，混匀，置室温2h，于4℃对2000ml PBS透析过夜，并换液一次。将混合液用PBS加至4ml，4℃下保存，待纯化。
3.1.2戊二醛二步法将10mg HRP溶于0.2ml含1.25％戊二醛的PBS（pH6.8）中，置室温过夜。对生理盐水透析或过Sephedex-G25柱一次，以去除游离的戊二醛，再用生理盐水调到1.0ml，此即为活化酶液。取1.0ml含5mg IgG与1.0ml活化酶液混合，再加人0.1ml碳酸盐缓冲液（pH9.5），混匀后置4℃下24h。取出加入0.lml 0.2mol/L赖氨酸溶液，置室温2h，再于4℃下对PBS（pH7.2）透析过夜，待纯化。
3.1.3过碘酸钠法（Nakane氏法）：将4mg HRP溶于1.0ml蒸馏水中，加入新配制的O.1mol/L的过碘酸钠，置室温搅拌20min，此时溶液颜色从棕黄色变为灰绿色，如颜色不变，需添加NaI04溶液。于4℃对lmol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH4.4）中透析过夜。将lml含8mg IgG的生理盐水溶液加于上述酶溶液中，随即加入15ul 1.0mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.5）于室温下搅拌2h。再于混合液中加入0.1ml新配制的NaBH4或KBH4溶液（4mg/ml H20），4℃下放置2h。于4℃下对PBS透析过夜。并保存4℃下待纯化。
3.2酶结合物的纯化和保存
3.2.1纯化：酶结合物的纯化的目标是除去标记物中游离的酶，降低非特异性反应，除去未标记的抗体，以提高标记物的反应强度，纯化酶结合物的方法很多，但一般常用的纯化方法有：应用50％饱和硫酸铵盐析法，即可使标记抗体与酶的单体或二聚体分子分开，但仍残留未标记的抗体。应用Sephadex G200过滤则可将标记抗体与未标记的抗体分开。
3.2.2保存：将纯化的酶标记物溶液，加入牛血清白蛋白（BSA）至终浓度为1%有助保存。长期保存时，则加人等体积的甘油，分装小瓶于-20℃保存即可，切忌反复冻融，最好用冷冻、干燥、真空保存于低温（4～8℃）。
3.3酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率的测定等。
3.3.1酶与抗体活性：常用的方法为琼脂免疫扩散或免疫电泳，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1d，再用蒸馏水浸泡1h，将此琼脂凝胶片浸人酶底物溶液中着色。如出现应有的显色反应，再用生理盐水浸泡仍不褪色，表示结合物既有酶活性，也有抗体活性。良好的结合物于显色后，琼扩滴度应在1：16以上。还有另一种用系列稀释结合物的方法，直接以ELISA法进行滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可确定结合物的使用浓度。
3.3.2结合物的定量测定：对结合物中的酶和IgG的定量系用紫外分光光度计于OD4.3nm和OD280nm进行测定，按下列公式计算。
A.酶量（mg/m1）=OD403nm×0.4
B1.IgG量（mg/m1）=（OD280nm－OD403nm×0.42）×0.94×0.62
B2.IgG量（mg/m1）＝（OD280nm-OD403nm×0.34）×0.62
注：B1系采用戊二醛为交联剂标记抗体的IgG的定量；B2为用过碘酸钠氧化法标记抗体的IgG定量。
在已知结合物中酶量和IgG量之后，按下列公式即可计算出标记抗体的摩尔比值。
C.HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/m1）/IgG1（mg/m1））×160，000（IgG分子量）/40，000（酶分子量）=HRP（mg/ml）/IgG（mg/m1）×4
D.结合物中酶总量=HRP（mg/m1）×结合物溶液量
E.结合物的酶结合率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100％
据实验报告表明，用于ELISA的结合物酶量400ug/ml效果一般，500ug/ml较好，1000ug/ml效果最为理想。摩尔比值为0.7时效果一般，1.0时较好，1.5～2.0时最好。酶结合率7％时效果一般，9％～10％较好，30％以上最好。
4.ELISA方法的基本类型、用途及操作程序根据ELISA所用的固相载体两区分为两大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot－ELISA）。又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA等等。
4.1ELISA试验的基本操作程序
4.1.1包被：将溶于包被缓冲液中一定浓度的抗原（或抗体），加入微量滴定板，每孔100ul，置4℃下作用12h，用PBS-T洗涤3次，甩干。
4.1.2分层加样：各孔加入与包被物相对应的试样100ul，37℃感作1～2h，同上法洗涤3次，根据试验需要可加一层、二层或更多层次的试剂，每加一层均需同上法反应、洗涤。
4.1.3加入酶标记物：最后一层必须加入与前一层相对应的标记抗体（或抗原）100ul也可用能与上一层相结合的其他酶标记物，如酶标SPA，37℃作用1～2h后，洗涤3次。
4.1.4显色：各孔加入底物溶液100ul，室温20～30min，加2M H2S0450ul终止反应。
4.1.5判定：定性试验一般可用肉眼观察判定结果。定量试验结果，需用分光光度计测定光密度吸收值判定结果，但测定吸收值所用的波长则随底物而异。
