4.4.1操作步骤：使用细针头，将布氏杆菌水解素注射于羊尾根皱褶或肘关节无毛处皮内，剂量为0.2ml。注射前应将注射部位用酒精棉消毒，每注射1只羊，均需用酒精棉消毒针头。如注射正确，会在注射部位形成绿豆大的硬包。布氏杆菌病羊在注射部位发生炎性反应（水肿，略潮红），而健羊则无此反应。
4.4.2结果判定：注射后24h和48h各观察1次（用肉眼观察和触诊方法检查注射局部反应）。若两次观察反应结果不符时，以反应最强的一次作为判定依据。判定标准是：
强阳性反应（+++）：注射部位有明显不同程度的肿胀和发红（硬肿或水肿），无需触诊凭肉眼即可察出者。
阳性反应（++）：肿胀程度不如上述现象明显，但也容易看出。
弱阳性反应（+）：肿胀程度也不显著，有时需靠触诊才能发现。
疑似反应水（±）：肿胀程度似不明显，通常需与对侧比较才能察觉者。
阴性反应（一）：注射部位无任何变化。
可疑反应羊经30d后复检。复检如无反应，即以健康羊对待；如仍为可疑，则按阳性羊处理。
4.4.3注意事项：启封后的剩余水解素不得继续使用。注射水解素后，健康羊不产生凝集素，病羊的凝集素不增高，所以不影响血清学检验。
4.5鼻疽变态反应检验
4.5.1鼻疽菌素点眼试验
4.5.1.1点眼前准备：在进行点眼前的第ld选好马骡集中场所，作好一切准备工作。
4.5.1.2组织人员分工：术者1人，助手1人，记录1人，保定1～2人。
4.5.1.3器材准备。消毒点眼管2～3支，消毒盘1个，适量鼻疽菌素（马来因），硼酸棉球，纱布，记录本，来苏儿，工作服，口罩，眼镜，毛巾及保定用具。
4.5.2点眼注意事项
4.5.2.1拴马时必须背向太阳，在厩内时，马头需向通路。
4.5.2.2点眼前应详细检查眼内有无异物，结膜、角膜有无损伤。正常者方可进行点眼。点眼毕，检查颌下淋巴结、皮肤及鼻腔。均应详细记录。
4.5.2.3一般均点于左眼，如左眼有异常则点右眼，但必须在笼头上系1布条作为标志。
4.5.2.4点眼时间一般规定从早晨开始，争取在9点钟前结束。
4.5.2.5点眼试验第1次呈阴性及疑似反应者，应作第2回点眼，其间隔为5～6d。每次点眼用鼻疽菌素原液3—4滴，第2次点眼时应点人同一眼中。
4.5.2.6点眼后，马匹应拴系确实；防止风沙侵入及阳光直射；指定专人看管，防止马匹相互啃咬或摩擦眼睛。
4.5.3操作方法：点眼时，由助手固定马头，术者左手食指插入上眼睑窝内，使瞬膜露出，用拇指拨开下眼睑，使瞬膜和下眼睑构成凹陷，右手持吸有鼻疽菌素的点眼管保持水平方向，手掌下缘放在颌骨的眶部，点眼管尖部距凹陷约1cm，拇指按胶皮乳头，滴入鼻疽菌素3～4滴（0.2～0.3m1）。此时，马如频频瞬睫，低头砸唇，即为点眼确实，若伸颈使瞬膜露出或闭眼流泪甚多时，有时可能将鼻疽菌素排出，应立即重点1次。
4.5.4检查时间：应在点眼后第3h、6h、9h共检查3次，并尽可能做到在第24h再检查一次。在第6h检查时，要翻开眼睑，其余时间观察，必要时亦应翻开眼睑检查。
4.5.5判定标准
阳性反应（+）：结膜发炎，肿胀明显，分泌物为脓性者。
疑似反应（±）：结膜潮红，轻度肿胀，分泌物为灰白色浆性及黏性（非脓性）者。
阴性反应（一）：点眼后无反应者，或结膜轻微充血及流泪者。
4.6鼻疽菌素皮下注射试验（热反应）
4.6.1注射前注意事项：皮下注射前1d，被检动物必须作一般临床检查，于早、午、晚测3次体温并详细记载。体温正常者方可作皮下注射。在3次体温记录中，其中如有一次超过39℃和3次平均体温超过38.5℃，以及在前1次皮下注射后，尚未经过1个半月以上者，均不得作皮下注射。
4.6.2注射部位及剂量：注射部位通常在颈左侧或肩前胸部。注射前，术部先行剪毛消毒，注射量为鼻疽菌素原液lml。
4.6.3注射时间：通常在夜间12点钟注射，自次日晨（即注射后第6h）开始测温，每2h测温1次，连测10次，再于第36h测温1次，将测温结果记录下来划成曲线，并记录局部肿胀程度，以备判定。
4.6.4注射后注意事项：注射后的牲畜在24h内不得使役，并不能饮冷水。
4.6.5注射后的反应：皮下注射鼻疽菌素后，马、骡、驴及骆驼均可发生体温反应及局部或全身反应。
4.6.5.1体温反应。鼻疽病畜经皮下注射后，至第6-8h体温开始上升，第12～16h体温升到最高峰，以后即逐渐降低，亦有于第30～36h内体温再度轻微上升。
4.6.5.2局部反应。注射部位发热、肿胀、疼痛，以24～36h最为显著，直径可达10～20cm，继而逐渐消散，有时肿胀持续2～3d。
4.6.5.3全身反应。注射后精神不振，食欲减退，呼吸急促，脉搏加快，步态踉跄，战栗，大小便次数增加，颌下淋巴结肿大等。
4.6.6判定标准
阳性反应：体温升到40℃以上，呈稽留热，并有轻微的局部反应，或体温稽留在39.6℃以上，并有显著的局部反应及全身反应。
疑似反应：体温虽有升高，但不超过39.6℃，且有轻度的全身反应及局部反应等，或体温一度升到40℃而不稽留并无局部反应。
阴性反应：体温在39℃以下，并无局部及全身反应者。
皮下反应法比皮内法操作繁琐，而且检出率低，反应不如皮内法敏感易判，因此较少采用。
三、免疫电镜技术
近年来，免疫学方法与电镜技术相结合，形成了一种免疫电镜技术（Immuoelectronmicroscopy，IEM），使抗原定位达到了亚细胞水平。免疫电镜技术为抗原亚细胞水平定位提供了有力工具，也为病毒病快速诊断提供了一个新方法。近几年来，有些科技工作者利用不同标记物在电镜下呈现不同的形态和电子密度的特点，建立了一些双标记或多标记免疫电镜技术，可在同一反应系统中，同时观察不同抗原及受体在细胞表面和细胞结构中的定位。该项技术由以下环节组成：
1.组织准备用于免疫电镜检测的组织多种多样，所以各自在组织制备时都有其特点。一般讲，组织力求新鲜并进行无活力状态处理，例如树胶包埋等，避开高温（55～66℃），所用溶液应是中性缓冲、掖。
1.1固定：常用的固定液有甲醛和戊二醛。使用时要注意固定试剂pH值，渗透压应调整到“生理”状态。另外四氧化锇也是一种良好的膜稳定剂。
1.2固定后处理：组织长时间浸于脱水溶剂、液相树脂中时而会抽走分子较小的可溶性抗原，另外超薄树脂包埋切片长时间与免疫试剂作用（如24—48h）会引起形态学的改变，而采用冰冻切片在很大程度上弥补了这一缺点。近年来，有人在后处理时对组织进行急冻，然后真空抽干.再用锇蒸气固定后，用阿拉伯树脂包埋。
2.切片制备冰冻超薄切片是免疫电镜技术中应用最广泛的。先将细胞或组织轻微固定后，用2.3mol几蔗糖浸润速冻，然后进行切片。辣根过氧化物酶标记，或胶体金、铁蛋白、葡萄糖铁标记的抗体均可用于该方法的免疫染色。
2.1包埋前处理技术：这一方法作为首选用于细胞表面抗原及受体的定位，亦可用于检测那些易被脱水剂及树脂成分变性的抗原。首先用切片刀将新鲜或固定的组织切成20至几百微米厚，然后用改良的间接免疫酶技术进行染色，在试剂中加入TlitonX－100增加其穿透性，用四氧化锇固定，增加吼姬染色反差。最后再包埋制成切片。一般认为，在组织中切面下方2～4脚是染色较理想的部位。
2.2包埋后切片技术：包括两种方法，一是用包埋好的组织切成一般切片，免疫染色后用于光镜检查，同时作系列超薄切片染色并用电镜观察，将光镜得到的结果与电镜观察结果比较，推断抗原所在部位，这一方法的缺点是不能在亚细胞水平直接定位。另一种方法将包埋后组织直接进行超薄切片染色，酶标记与胶体金标记的抗体可用这一方法。
3.标记物选择
3.1辣根过氧化物酶：是最常用的一种标记物，性质稳定，分子量小，易穿透组织，在标记过程几乎不受损。其底物为3，3“-二氨基联苯胺，可通过锇化或氯化钴作用增加其电子密度。
3.2铁蛋白及葡聚糖铁颗粒：首先用免疫电镜标记的是马脾脏铁蛋白.应用双功试剂（如间位苯二甲基二异氰酸m-Xylylene diisocynste）可将铁蛋白偶联于抗体球蛋白分子上，因铁蛋白分子量大不易穿透，故常采用冰冻超薄切片技术和包埋前处理切片技术.葡聚糖铁颗粒用于免疫标记进可采用上述方法。
3.3放射性标记：该方法已有人应用，采用内标记法将同位素标记到抗体球蛋折分子上。
3.4重金属：应用不广泛。用胶体金、水银、铁、铀标记抗体等。铀离子能非特异性的结合在整个抗体分子上。因此需先将抗原与抗体结合，再将抗原与抗体分开，除去抗原成分，即得到未失去免疫活性的铀标记抗体。胶体金能吸附于免疫球蛋白上，吸附的抗体以30000r／min离心沉淀，胶体金标记抗体可保存6个月（5℃），不耐冻结。
3.5血蓝蛋白：无脊椎动物的血蓝蛋白形态规则，在电镜下容易辨认，可从鲎、角螺、文蛤等的血淋巴液中提取，其分子量达900万，可用ConA、戌二醛将抗体球蛋白分子联结于血蓝蛋白上。
4.免疫电镜技术操作方法标记抗体染色程序可根据不同需要，进行直接法、间接法、杂交抗体等方法，就像酶标记抗体一样。下面介绍几种常见的免疫电镜操作程序。
4.1病毒的电镜凝结试验：近年来由于电镜技术的发展，病毒的电镜凝结已被用作常规的检验手段。用于电镜检查的病毒悬液需先经适当的提纯和浓缩。细胞培养中的病毒经冻融裂解后，差速离心使病毒沉淀，将沉淀的病毒悬于适量生理盐水中，取一滴病毒悬液和一滴抗血清，混合后4℃过夜，然后再加一滴3％磷钨酸负染，滴于被有炭膜的铜网上，吸干，即可作电镜检查。可见病毒颗粒凝结成团，并见有抗体分子的晕，病毒颗粒之间保持着一定距离。在最佳透射条件下，可看到单独的、近球形的抗体分子，有时在病毒颗粒之间连成桥。检查时，要注意与自然形成的病毒团相区别，必需设未加血清的对照。电镜凝结试验可进行病毒的确切鉴定。
4.2冰冻超薄切片的免疫染色：将组织用甲醛或戌二醛固定，切成0.5mm3大小，置0.6～2.3mol/L蔗糖溶液渗透，然后速冻（液氮等），超薄切片，展于用炭膜包被后的铜网上，切片面向下置于含0.3％琼脂和1％明胶的湿盘上，通过渗透作用除去蔗糖，再用含0.01～0.2mol/L甘氨酸的PBS（PBS-g）漂浮铜网，然后在铜网上滴加含2％明胶PBS，放置10min，再按下列步骤进行：
4.2.1PBS-g液中置10min后，PBS漂洗；
4.2.2采用工作浓度的抗血清孵育，稀释液中常加明胶或白蛋白（0.4W.V），孵育的温度与时间都需要试验比较得出；
4.2.3PBS漂洗；
4.2.4胶体金标记二抗（工作浓度、作用时间和温度均需进行测定）作用后，PBS漂洗；
4.2.5置于含2％戌二醛水溶液中5min，水漂洗，晾干后电镜观察。注意同时设置阴性、阳性对照。
4.3辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶（peroxidaseantiperoxida-se，PAP）组化法：这一方法主要用于包埋前切片技术。首先将组织用含4％甲醛和0.2％戌二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）浸泡固定2～4h（4℃），再用2.3mol/L蔗糖溶液渗透6～8h，液氮速冻后放在2.3mol/L蔗糖溶液中解冻，然后转移到PBS中。这一速冻和解冻过程主要是为了不影响超微结构的前提下冻破细胞以利于标记物及免疫试剂的顺利穿透。步骤为：
4.3.1用Vibratome将组织切成20～50ffm厚的薄片；
4.3.210％正常血清（如羊或猪血清）作用30—60min，PBS漂洗；
4.3.3加一抗（如兔血清）作用过夜；
4.3.4加二抗（羊抗兔血清1：10～1：100）作用lh，PBS洗；
4.3.5与辣根过氧化物酶-兔抗辣根过氧化物酶复合物（PAP）（1：50）作用1.5—2h，PBS洗；
4.3.6置于含0.06％DNA、0.01％H202的0.05mol/LTris-HCI pH7.6溶液中10min，然后浸入PBS溶液中终止反应；
4.3.7用1％四氧化锇作用2h，PBS漂洗；
4.3.8脱水进行树脂包埋，制电镜超薄切片后观察。
