6.2待克隆化的阳性融合细胞，可先转入24孔板扩大培养后再克隆，也可边扩大边从96孔板取样直接克隆。用吸管将细胞群吹打分散，制成悬液，按前述方法精确计数活细胞数。从96孔板直接取样克隆，计数取样只用1滴悬液，用另一支滴管加无血清培养液9滴作10倍稀释，计数。用HT培养液将细胞稀释至每毫升5、30和50个细胞各40ml；
6.3每种杂交瘤细胞用一块备用的含饲养细胞的96孔板，每个稀释度32孔，每孔加细胞悬液0.1ml，每孔应含0.53和5个细胞。由于计数和加样的误差，往往偏高或偏低。如从96孔板直接取细胞克隆时，应在克隆完后立即把孔中和稀释管中剩余细胞全部转入24孔中扩大培养，以备失败时重新克隆；
6.4在37℃5％～7％培养箱中培养7d左右，镜检，标出所有板孔的细胞群落数。按融合所述方法采样，进行抗体检测。
6.5将单克隆阳性的细胞先转入24孔，后在培养瓶中扩大培养，然后冻存。
6.6对于新融合的杂交瘤细胞，一般至少克隆2～3次。对于冻存的克隆细胞株，在复苏时，最好同时克隆化，以不断清除变异细胞，保持分泌抗体的稳定性。
7.细胞的冻存和复苏
7.1冻存液：20％小牛血清，10％二甲基亚砜（DMSO），70％基础培养液，混匀，冰浴或冰冷。
7.2冻存方法与步骤：收集处于对数生长期的细胞，离心沉淀，按每毫升5×106～5×107个最终细胞浓度，重悬于冻存液中，按每瓶lml，分装于2ml安瓿中，火焰封口，标上细胞名称，冻存日期，装入布袋中。将细胞置于泡沫塑料容器内，放入-70℃超低温冰箱内，次日取出，立即投入液氮罐保存。或将细胞在4℃放置1h，然后移入液氮罐口，每5min下降2cm，在液氮面上停留30min以上，再浸入液氮中。
7.3复苏方法与步骤：从液氮中取出细胞安瓿，放人37℃水浴中，轻轻摇动，当只剩一点冰块时，即取出置冰浴上。打开安瓿，将细胞移人含10ml无血清基础培养液的尖底离心管中，轻轻摇动，离心沉淀，弃上清，用3～4ml全培养液或HT培养液重悬，移入5ml细胞培养瓶中，置37℃，5％～7％CO2温箱中培养。如镜检时死细胞较多，可向培养液中加入最终浓度为每毫升104～105个动物腹腔巨噬细胞。
8.单克隆抗体的生产单抗分体内生产法和细胞培养生产法，在一般实验室条件下，体内生产法最为常用。
8.1动物体内生产法：将0.5ml液体石蜡或降植烷注入Balb/c动物腹腔；7d后每只动物腹腔接种0.2ml计5×105个细胞；5d后每天观察动物腹部，当用手触摸时皮肤有紧张感时，即用16～18号针头采集腹水，如采2～3次，每只可采5～l0ml腹水，抗体含量为每毫升1～5mg左右；离心管去细胞和其他沉淀物，收集上清，测定效价，分装，-70℃存放。纯化前，膜滤或高速离心再次除渣。
8.2细胞生产法：一般实验室制备单抗常用单层培养法。当细胞密度为1×106～2×106/ml时，上清中的单抗体浓度为10～50ug/ml，所以大量生产单抗必须提高细胞密度。目前用于大量生产的是悬浮培养和细胞固定化培养两大类，请参阅有关文献。
9.杂交瘤技术操作中应注意的主要问题
9.1对所用的骨髓瘤细胞的使用历史要清楚，一定是没有污染的曾获得高融合率的可靠细胞。融合时，骨髓瘤细胞要处于最佳生长状态。
9.2用于融合的主要试剂，如聚乙二醇（PEG）、胸腺嘧核苷（T）、次黄嘌呤和小牛血清的质量要可靠，特别是小牛血清和PEG，就是同一厂家不同批次产品的质量差异也影响融合的培养效果。在实验室中一定要贮备经过融合考验的主要试剂。对每批小牛血清都要作细胞生长试验。
9.3配液用的水质好坏也是一个重要问题。一般来说，无离子水再经双蒸或三蒸水用于配制各种液体是没有什么问题。
9.4在进行杂交瘤试验之前，要调好培养箱温度、CO2浓度，使其稳定，并保持饱和湿度。
9.5严格无菌操作对搞好杂交瘤技术是至关重要的。一切用于培养的液体均需十分可靠。各种培养液的包装尽量要小。同一包装的液体最好一次用完，不能多次重复使用。每次使用的剩余液体要放在37℃温箱菌检。
大多数杂交瘤实验室的问题的发生在污染和血清质量两个方面。只要这两个方面多加注意，一般都较顺利。
10.单抗的鉴定在杂交瘤细胞建株时，要对每种单抗的特异性、同质性和理化性质等进行鉴定，以便应用。
10.1特异性：单抗具有抗原表位特异性。在免疫动物过程中，抗原在机体有多少个表位暴露出来，就应产生多少种单抗。一个复杂抗原往往有株、亚型、型和属特异性表位，有的还存在属间交叉表位。相应地，单抗也应有上述特异性之别。病毒表位有中和和非中和之分，相应地，单抗也有中和及非中和单抗。不同抗原表位属于不同抗原成分之上，决定免疫学反应性质。如针对新城疫病毒HN糖蛋白N端抗原表位的单抗具有较强的血凝抑制反应能力，而针对核衣壳蛋白抗原表位的单抗就没有血凝抑制能力。鉴定单抗特异性，应根据不同目的，采取不同方法。欲鉴定单抗是株间、型间和属间特异性，需收集不同型和同一型的不同毒（菌）株以及类属病毒（菌），通过血清学方法（如ELISA），观察与之反应的程度，确定特异性范围。一般通过中和反应鉴定单抗是否具有中和反应能力。要明确单抗的靶抗原是哪种成分？往往通过免疫印迹法或放射免疫沉淀法。
10.2同质性：单抗的同质性（即单克隆性）主要指免疫球蛋白重链和轻链类型单一性、电泳均一性和杂交瘤细胞染色体数目等性质。
10.2.1重链和轻链类型：鉴定单抗重链和轻链类和亚类不仅可阐明单抗的同质性，而且确定单抗重链的类和亚类也有助于提纯方法的选择和了解其参与不同的免疫学性质的能力。单抗最常见的是IgG和IgM类，IgG又分为Gl、G2a、G2b和G3四种亚类。鉴定单抗类和亚类时，通常采用琼脂扩散法。先将杂交瘤细胞上清单抗浓缩20～30倍，与抗动物类和亚类血清反应，观察沉淀线。也可不浓缩上清液，用抗动物类和亚类抗体的酶结合物，通过ELISA鉴定。鉴定动物轻链是链还是k链的方法与上述鉴定重链的方法相同，也是通过免疫扩散试验或ELISA来确定。
10.2.2电泳均一性：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电聚焦电泳及免疫电泳等均可鉴定单抗的均一性。
10.3理化特性：明确单抗在温度、pH变化的稳定性和与抗原的亲和力对应用十分重要。一般来说，纯化的单抗，在56℃加热5min，即失去活性。而未纯化的腹水和血清单抗以及纯化的多抗，56℃灭活后，活性没有明显变化。单抗经反复冻融，明显丧失活性。加等量甘油，置30℃，因不冻结，保存一年以上活性不变。纯化的单抗在pH6.0～8.0下稳定，pH9.0～10.0活性明显降低。但多抗活性在pH6.0～10.0不变。
不同单抗亲和力不尽相同。一般通过竞争ELSA测定亲和常数，以比较不同单抗相对亲和力的大小。其操作步骤如下：
10.3.1取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜；
10.3.2洗涤后加封闭液（0.5％BSA-PBS，pH7.2），100ul/孔，37℃，lh；
10.3.3取一定浓度的纯化待检单抗与系列倍比稀释抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡（抗原浓度要过量）；
10.3.4洗涤后将平衡后的抗原-抗体混合物加入酶板孔中，100ul/孔，37℃，lh；
10.3.5洗涤后，加HRP标记的抗动物第二抗体，100ul/孔，37℃，lh；
10.3.6洗涤后加底物（OPD）溶液，100ul/孔，37显色15min，2mol/LH2SO4终止反应，于495nm波长测定各孔吸收率（A）。
第三节核酸扩增技术
核酸扩增包括聚合酶链反应、连接酶链反应和Qβ复制酶技术等。下面分别叙述。
一、聚合酶链反应
聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）由美国Centus公司的Ksry Mullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外的快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得者大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫诊断中用于微量样品的检测，另外也可与血清学（如ELISA）结合应用。
1.PCR的基本原理和过程PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下，依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA作为模板，以和模板正常和负链末端互补的两种寡核苷酸作为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合（退火）、引物延伸合成DNA构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样，目的DNA数量将以2n～2n形式累积，在2h内可扩增30（n）个循环，DNA量达原来的上百万倍。PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物Mg2+存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。
2.PCR反应条件和反应系统的组成
2.1反应条件：PCR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30s，55℃退火30s，70～72℃延伸30～60s，依此条件进行30次左右的循环。
2.2PCR反应系统的组成：标准的PCR反应体系一般选用50～100ul体积，其中含有：50mmol/L KCL，10mmol/L Tris.HCl（室温，pH8.3），1.5mmol/L MgCl2明胶或牛血清白蛋白（BSA），2种引物，各0.25umol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）各200ul，模板DNA 0.1ug；TaqDNA聚合酶2.5IU。
3.PCR基本操作一个典型的PCR反应可按以下步骤进行：
3.1将下列成分依序加入0.5ml灭菌离心管中并混匀：
灭菌双蒸水30ul
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物，每种浓度为1.25mmol/L 16ul
引物15ul（100pmol），
引物25ul（100pmo1），
模板DNA 2u1
加灭菌双蒸水至终体积100ul
3.2置94℃加热5min
3.3将0.5ul TapDNA聚合酶（5IU/u1）加入反应混合液中
3.4将100ul轻矿物油加入混合液表面，以防水分蒸发
3.5按所设定的反应条件进行循环反应（在PCR仪上进行）
3.6反应终止后，取样品进行凝胶电泳，Southern杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。
4.PCR衍生技术PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR（RT-PCR）以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。
4.1反转录PCR reverse tranion PCR，PT-PCR）：RT-PCR用于扩增RNA样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA作为PCR的模板，加人引物和TapDNA聚合酶按正常PCR方式扩增cDNA。这一技术广泛应用于RNA扩增和RNA病毒的检测。
4.2锚定PCR（Anchored PCR）：通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA3ˊ端加上同源多聚物（polydG）尾，通过与其与互补的锚定引物（polydC）来保证扩增反应的特异性。
