dnaj基因编码应激蛋白，具有高度的保守性。dnaj基因序列既用于分枝杆菌的菌种鉴定，也可以用于推导分枝杆菌的种系发生关系。dnaj基因的PCR扩增产物内有种特异的限制性酶切位点。用SmaI、NaeI、HinfI 和FokI 4种限制性内切酶能将13种非结核分枝杆菌分成9组，并能将鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌加以区别。但这4种酶不能鉴定有些分枝杆菌菌种。gyrB基因编码DNA旋转酶的B亚单位，研究发现gyrB 基因进化率不仅快于核糖体基因，而且相对于其他蛋白编码基因也较快。因此，gyrB 基因分析特别适用于菌株的区别和鉴定。其显著优点是：目前存在通用引物可以从较大范围细菌谱中成功扩增DNA。此外，所扩增的目的片段，约1.2～1.4kb，不仅有利于系统发育分析研究，而且包含可变区和保守区。以gyrB 基因为靶基因设计基因芯片来检测分枝杆菌属，显示基因芯片鉴别分枝杆菌达到种水平，并且能区别密切相关的菌种，如牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，将结核分枝杆菌复合群与密切相关但临床意义不同的菌种，如鸟分枝杆菌、海分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、胞内分枝杆菌相区别对临床治疗具有重要的参考价值。此外，有前途成为分枝杆菌菌种鉴定的靶基因还有编码核糖体成分的23SrRNA基因、编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因，但是，目前开展的研究远不及16SrRNA 等靶基因。
PCR-限制性片段长度多态性分析
不同种菌种间的差异，其本质是DNA水平上核苷酸序列存在差异，这种差异可影响限制性内切酶的切割位点。经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性，分析其差异，可对分枝杆菌菌种进行鉴定。早期应用染色体DNA进行RFLP分析来鉴定菌种，但由于电泳后条带杂乱，结果分析较困难。PCR－RFLP通过先用分枝杆菌属特异性引物对标本DNA进行扩增，再经RFLP分析来鉴定菌种。
Vaneechoutte等对分枝杆菌属特异的16SrDNA片段PCR扩增，所得DNA片段（1500bp）经Cfo I、Mbo I、Rsa I 酶消化，电泳分析酶切谱型可对分枝杆菌进行鉴定。1998年，Sansila 等用特异性更强的16SrRNA-23SrRNA ITS引物扩增380bp片段，经Hae Ⅲ酶切后，结核分枝杆菌复合群和鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌均产生特征性谱型，经MspⅠ消化后能鉴别胞内分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌。Telenti等应用PCR扩增hsp65的一段基因片段（439bp），并用BstEⅡ和HeaⅡ酶切消化分析34种分枝杆菌，显示出不同分子量的带谱图谱。Devallois等也应用PCR-RFLP对常见分枝杆菌进行分析，均产生可鉴别的带型，该方法可鉴别最常见的致病性分枝杆菌。显示了该技术结合hsp65编码基因非常适合分枝杆菌的鉴别诊断。此外，Niemann等对gyrB DNA 序列扩增出1020bp的片段，用3种限制性酶酶切可以将结核分枝杆菌复合群区分开。
用PCR－RFLP的技术关键在于选择合适的引物和限制性内切酶，以尽可能鉴定出常见的致病分枝杆菌。本技术方法相对简便易行、快速准确，然而由于电泳受多种因素影响，难于规范和统一试验条件，不适宜产业化。
基因芯片技术
1998年Gingeras等首次应用高密度寡核苷酸阵列以rpoB基因做靶基因鉴定分枝杆菌菌种，分析10种共121株分枝杆菌的705bp rpoB 基因序列，MTB和其他9种NTM每种都有其特有的核苷酸定位，形成特定的杂交模式，借此可将分枝杆菌正确鉴定至种。1999年Troesch等应用16SrRNA基因芯片（分析200bp片段）检测经传统方法鉴定的27种不同分枝杆菌的70株分离株，结果下列菌种的所有分离株均被正确鉴定：亚洲分枝杆菌、龟分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、Conspicuum分枝杆菌、库氏分枝杆菌、偶然分枝杆菌、微黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、Interjectum分枝杆菌、中间分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、Shimodei分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、泥炭藓分枝杆菌、结核分枝杆菌和蟾分枝杆菌；4株鸟分枝杆菌分离株中，1株基因芯片鉴定为胞内分枝杆菌；4株胞内分枝杆菌分离株中，也有1株基因芯片鉴定为鸟或副结核分枝杆菌。由于鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、牛分枝杆菌和结核分枝杆菌、龟分枝杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种在其基因芯片上的16SrRNA序列相同，因此相互之间无法鉴定。
研究人员根据19种分枝杆菌标准株的16SRNA序列设计寡核苷酸探针，制备DNA微阵列，鉴定19种分枝杆菌标准株、9种非分枝杆菌标准株和31株分枝杆菌临床分离株。结果显示，DNA微阵列与9种非分枝杆菌标准株不杂交，具有分枝杆菌属特异性；可将19种分枝杆菌标准株鉴定到群或种，具有较高的分枝杆菌种特异性。31株分枝杆菌临床分离株中，9株鉴定为结核分枝杆菌复合群；22株NTM，除其中3株与该阵列杂交阴性，可能是DNA微阵列上无该菌种探针所致外，其他19株NTM可与芯片上的探针特异性结合，被鉴定至种或复合群的水平。但目前芯片的应用基本上只限于检测临床分离株，尚未直接检测临床标本。
反向系列探针杂交法
由于反向系列探针杂交技术操作相对简便、快速，且价格相对低廉，目前，许多学者也探索其在分枝杆菌菌种鉴定等领域的应用可能性。1995年，Kox等根据16SrRNA 高变区序列设计出一系列种特异性探针，通过反向印迹杂交试验能将临床标本中分枝杆菌鉴定至种。Sanguinetti等在Kox的工作基础上，将16SrRNA的种特异性探针从8个增加到16个，通过反向系列探针技术检测了5466份来自BACTEC液体培养基的分离株，其中检测出分枝杆菌阳性菌株459例，依据特异性探针杂交模式，检出的NTM包括蟾蜍、鸟、戈登、偶发、海、堪萨斯、龟、胞内、玛尔摩、土和日内瓦等共11种分枝杆菌，其结果与常规生化鉴定结果和HPLC进行分枝菌酸的鉴定结果一致，充分显示了反向系列探针杂交技术在分枝杆菌菌种鉴定中的简便、快速和准确的特点。
1997年，Patel等建立了PCR－ELISA（PCR－Enzyme－Linked ImmunosorbentAssay）微孔板杂交技术，也属于反向杂交技术范畴，其将分枝杆菌16SrDNA扩增产物在微孔板内与分枝杆菌16SrDNA种特异性寡核苷酸捕捉探针杂交，对分枝杆菌进行菌种鉴定，35株分支杆菌临床分离株中，34株得到正确鉴定。该方法也具备简便、快速的特点，显色反应类似于ELISA，适于在临床实验室推广应用。利用反向系列探针技术原理，目前国外已开发出进行分枝杆菌菌种鉴定的试剂盒，一个是INNO-LiPA Mycobacteria，由比利时的Innogenetics公司开发，一个是GenoType Mycobacteria，由德国的Hain Diagnostika公司开发，这些产品目前已在许多欧美国家的科研机构进行了大量的临床研究。应用INNO-LiPA Mycobacteria 和GenoType Mycobacteria 线条探针杂交试剂盒，Trombert-Paolantoni等检测了来自法国的临床分枝杆菌分离株，INNO-LiPA和GenoType Mycobacteria 对分枝杆菌的检出率分别为88％和95%。Sarkola等使用GenoType Mycobacteria检测来自芬兰的178株临床分枝杆菌分离株，89.3％的检测结果同使用16SrDNA序列测定结果吻合。不同作者使用探针阵列对分枝杆菌的检测敏感度存在差别，原因主要包括检测的靶基因不同，所设计探针的序列不同，特别是使用的研究材料不同。检测结果很大程度上决定于不同国家和地区分枝杆菌的种类、发病率和ITS序列的种内差异程度。
目前，关于分枝杆菌菌种鉴定的研究，无论是试剂盒研制，还是临床研究报道主要来自欧美发达国家。但已有较多的分枝杆菌菌种鉴定的报道显示，不同的地理区域分枝杆菌的发生率各不相同，种内的基因序列也存在较大差异，进一步加大对不同地区来源的分枝杆菌菌株的菌种鉴定靶基因进行深入研究，积累和补充相关的基因序列，开发、完善和优化分枝杆菌种特异性探针，将有可能使反向系列探针技术早日成为临床实验室快速、准确进行分枝杆菌菌种鉴定的新手段。
