结核阳性牛病料采集和保存
检查牛分枝杆菌，应采集异常淋巴结和实质器官，如肺、肝、脾脏等材料。对结核菌素反应阳性而没有病变的动物，应采集下颌、咽喉、支气管、纵隔、乳房及一些肠系膜淋巴结和肝脏进行检查和培养。收集样品的容器应干净无菌，若可能就用一次性塑料容器，容量50ml，能适于装各类不同样品。
一、采样时间
内脏的采取，须于死亡后立即进行，最好不要超过6小时，时间过长会导致其他细菌侵入，尸体进而腐败，影响病原微生物的检出。
二、器械消毒及准备工作
刀、剪子、镊子、针头等煮沸消毒30分钟；器皿高压灭菌；一次性注射器，灭菌试管，采样杯；采集一种病料使用一套器械和容器，不能混用。采样人需着防护服，戴手套、口罩进行操作。
三、采样部位
病料的选择根据感染部位。将病健结合部（此部位细菌活力最强）例如肺、肾等采取1～2cm3小方块，置于灭菌试管或平皿中，贴标签，填写采样单；采集血清需采用一次性采血器吸取血液10ml，置于灭菌试管中，待凝固后将血清置于另一个灭菌小瓶注明编号，统计采样资料，填写采样单；采集乳汁时需要先消毒乳房，弃去最初所挤的3～4股乳汁，然后再集10ml乳汁于灭菌试管中，标号，填写采样单；肠道的采集，用线扎紧一段肠道（6cm）两端，然后将两端切断，置于灭菌器皿中，标号后，登记采样单。
四、结核病病料保存
病料的保存可用超低温冷冻保存方法，采样杯的杯身和垂线末端可用标签将采样日期、采样部位、采样数量、采样人标出，同时将资料汇总，填写采样单。
送实验室的邮件，必须加垫、密封，以防溅漏。合适包装以防运送中破损。样品快速及时送到实验室，可增加牛分枝杆菌的培养复活机会。但是，如要不难及时送到，应将样品冷冻或冻结，防止污染菌生长，还可保护，在温暖环境下，可加硼酸（最终浓度为0.5%（W/V））作抑菌剂。所有操作包括培养都应在生物安全工作台上进行。
显微镜检查
检查牛分枝杆菌临床样品和组织材料涂片可用显微镜直接观察。病料涂片后进行抗酸染色，显微镜检查抗酸性杆菌，本菌的细胞壁不仅有肽聚糖，还有特殊的糖脂，因为糖脂的影响，致使革兰氏染色不易着色，能抵抗30ml/l盐酸酒精的脱色作用，抗酸染色为红色，常用齐-尼氏（Ziehl-Neelson）染色法，也可用荧光抗酸染色法。如果组织内有抗酸性微生物，并且具有典型的组织学病变，则可以做出初步诊断。抗酸染色法阳性率比较低，但它作为一种传统的检测方法，具有假阳性率低，价格低廉，操作简便等特点，在牛场中就可进行，所以仍有一定的实用价值。免疫过氧化物酶技术也可获得令人满意的结果。
一、齐—尼氏抗酸染色液配制方法
1、苯酚复红染色液
碱性复红饱和酒精溶液（100ml95％酒精中加3g碱性复红）10ml，5％苯酚溶液90ml，二者混合后用滤纸滤过。
2、3％盐酸酒精脱色液
浓盐酸3mL，95％酒精97ml，混匀。
3、骆氏美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g，95％酒精30ml。
乙液：0.01％氢氧化钾溶液。
将甲乙两液相混合。
二、涂片操作步骤
1、涂片
涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持在10mm以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次）。
2、染色
滴加石碳酸复红染液，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持染色部位被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。
3、冲洗
流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、脱色
自上端外缘滴加脱色剂布满玻片，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色涂片无可视红色为止。
5、清洗
流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
6、复染
滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。
7、清洁
流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水。待玻片干燥后镜检。
要求：一张染色合格的涂片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果报纸上的文字透过涂层不能被看清，表明该玻片涂抹过厚。
三、镜检步骤
1、读片
使用10倍目镜双目显微镜读片。
2、调焦
取染色完毕且已干燥的玻片，向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40倍物镜，转动卡尺移动至玻片左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40倍物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100倍油镜进行细致观察。在淡蓝色的背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁镜头直接接触玻片上的液体。
3、读片方法
首先应从左向右观察相邻的视野；当移动至玻片一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mm×20mm大小的部位，使用100倍油镜，每行可观察100个视野，观察三行则约为300个视野。仔细观察完300个视野，一般至少需要5分钟以上。一位镜检人员连续阅读10～12张玻片后应休息约20分钟。
4、分枝杆菌的基本形态
直接进行涂片镜检时，能够发现不同种的分枝杆菌形态。结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度0.3～0.6m；菌体长度不一，在0.5～8m之间，多数在1.5～3.5m；含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经萋—尼氏染色后，100倍油镜观察，可见单个存在的，也能看到聚集成簇或分枝状排列的菌体，染色良好组织标本，可见菌体内着色较深的异染颗粒。
四、镜检结果报告与登记
涂片镜检的结果报告，不仅对牛结核病的诊断提供依据，报告的数量也一定程度上反映了疾病严重程度和传染性的大小。涂片镜检结果的登记应按照镜检结果的分级报告标准登记在结核病细菌学实验室登记本上。不能只填写阴性、阳性或（－）、（+）等。
五、齐—尼氏染色镜检结果分级报告标准
抗酸杆菌阴性（－）：连续观察300个不同视野未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野。
抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条/100视野。
抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野。
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。
抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野。
六、抗酸染色玻片的处理
看完齐—尼氏染色玻片后，应立即用浸满二甲苯（分析醇）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。
涂片抗酸染色检查要注意预防假阳性和假阴性结果的产生。假阳性是指将阴性涂片错误判读为阳性，假阴性是指将阳性涂片错误判读为阴性。属于技术因素的影响要通过一系列实验室内和实验室间的质量控制不断改善。
七、假阳性结果的预防措施
必须使用新的载玻片进行涂片检查。
每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。
所有染液均经过过滤。
染色时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开。
严禁使用染色缸将玻片放置一起染色。
染色时勿使玻片上的染液干燥。
滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片。
严禁物镜镜头直接接触玻片。认真按照要求读片，准确记录和报告结果。
完整的标玻片和实验室登记本的各项内容。
登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
八、假阴性结果的预防措施
确认每份标本至少有3ml。
选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。
制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。
使用高质量染料、严格按照配方配制染液。
严格按照操作程序完成染色过程。
判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。
作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。
完整、准确地标注玻片和实验室登记本。
登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
准确记录和报告结果。
九、玻片的保存
镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯的擦镜纸彻底去除涂片上的镜油。
再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号。
严禁在涂片上标记镜检的阴阳性结果。
按实验室登记本序号连续排列全部涂片，存放于玻片盒内。
涂片保存与实验室登记本记录应保持一致。
保存近期3个月的全部组织涂片待各级实验室质量控制抽检，如果年涂片量不足500张，必须全部保存。
装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。
十、显微镜日常维护
显微镜作为发现阳性涂片的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予正确维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点。
显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。
使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。
严禁物镜镜头直接接触玻片上的液膜。
使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。
使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。
十一、镜检要求
防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的染色部位。
仔细观察300视野，不少于10分钟。
每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。
连续阅读10～12张涂片后，应休息20分钟左右。
十二、载玻片要求
新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。
一张载玻片只能涂抹1份标本。
载玻片只允许一次性使用，不得清洗后重复使用。
载玻片正面左侧1/3处用玻璃刻刀笔标记实验序号。
载玻片正面右侧2/3中央处均匀涂抹成面积为1.0×2.0㎝卵圆形液膜。
十三、染色要求
肉眼观察染色后的液膜应呈均匀淡蓝色，无红色斑块。
染色后的涂片放置在报纸上，如果文字透过液膜不能被看清，表明该涂片涂抹的太厚。
染色后的液膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。
牛结核杆菌的培养
血液或乳汁等样品，由于含菌量较少，如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外，在培养或做动物试验时，常因污染杂菌生长较快，使病原结核分枝杆菌被抑制。下列几种浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌，而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡，从而得到浓缩。
一、消化法
1、硫酸消化法
用4%～6％硫酸溶液将组织、尿、粪或病灶组织等按1：5的比例混合，然后置37℃培养箱中作用1～2小时，经3000r/m～4000r/m离心30分钟，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后，在沉淀物中加入3％氢氧化钠中和，然后抹片镜检、培养和接种动物。
2、氢氧化钠消化法
取氢氧化钠40g，钾明矾2g，溴麝香草酚蓝20mg（预先用60％酒精配制成0.4％浓度，应用时按比例加入），蒸馏水1000ml混合，即为氢氧化钠消化液。
3、安替福民沉淀浓缩法
溶液A：碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80ml。
溶液B：氢氧化钠15g、蒸馏水85ml。
应用时A、B两液等量混合，再用蒸馏水稀释15%～20％，制成安替福民溶液，该溶液须存放于棕色瓶内。将被检样品置于试管中，加入3～4倍量的安替福民溶液，充分摇匀后37℃作用1小时，加1～2倍量的灭菌蒸馏水，摇匀，3000r/m～4000r/m离心20～30分钟，弃上清液，沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
二、操作方法
1.方法一
将被检的组织、尿、粪便或病灶组织用氢氧化钠消化液按1：5的比例稀释混匀后，37℃作用2～3小时，然后无菌滴加5～10％盐酸溶液进行中和，将pH值调到6.8左右（此时显淡黄绿色），以3000～4000rp/m离心15～20分钟，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
2.方法二
在病料中加入等量的4％氢氧化钠溶液，充分振摇5～10分钟，然后用3000rp/m离心15～20分钟，弃上清液，加1滴酚红指示剂于沉淀物中，用2mol/l盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
3.方法三
在组织液或小脓块中加入等量的1％氢氧化钠溶液，充分振摇15分钟，然后用3000rp/m离心30分钟，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
4.方法四
对组织液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法：取1mol/l（或4％）氢氧化钠水溶液50ml，0.1mol/l柠檬酸钠50ml，N－乙酰－L－半胱氨酸0.5g，混合。取组织1份，加上述溶液2份，作用24～48小时，以3000r/m离心15分钟，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
