1955年上半年，U-2飞机制造完成。中央情报局连U-2飞机的海外机场也已安排好了。
在实施侦察飞行前，美国政府先放了一颗“烟幕弹”：由美国民间机构——国家航空顾问委员会——出面，宣称该机构已成功研制出一种新型号的高空气象研究飞机，准备在1956年春季开始飞行。
1956年.6月底，一切准备就绪，艾森豪威尔下令正式飞行。
1956年7月4日，第一架U-2飞机从西德威斯巴登起飞，对苏联做第一次入境侦察飞行。飞机飞过莫斯科、列宁格勒，沿波罗的海海岸飞行，而后再往回飞。
选择这样一条航线风险很大，但第一次飞行飞机经受住了考验，飞行情况良好，一切顺利。接着，又连续飞了四次，都安全返航。
这五次飞行拍摄了大量照片，内容丰富，收获可观。像莫斯科和列宁格勒地区，都是戒备森严的禁地，照片上两城周围的工业和武装防卫设施清晰可见。有些照片从情报分析的价值上说十分珍贵，如导弹发射场，原子工厂和飞机场，等等。
此外，美国中情局还弄清了苏联空军的实力。美国一直害怕苏联的喷气式飞机，如YA-4野牛型和TU-95型等。然而，根据后来的情况看，苏联飞机对U-2的威胁不是很大。
针对U-2飞机的挑衅，苏联很快发出了抗议照会。在照会中，苏联政府列举了最初两次U-2飞机的飞行路线、侵入的深度、侵入和逗留的时间，等等。苏方照会最后说，这是美国飞机对苏联边境领空的蓄意侵犯，完全是出于侦察的目的。照会的内容除没有提到拍摄照片的问题外，其他如U-2飞机的高度、速度、航程等性能都已涉及，表明他们的观察细致而准确。但关键的一点是，苏联方面没有足以阻止U-2飞机侦察的具体办法。
苏联的战斗机飞不到U-2飞机的高度，他们的防空导弹最高只能打到1.8万米，只要一超过1.8万米，进入稀薄气层，制导立刻失效。中央情报局原以为苏联防空导弹能达到2万米的射程，实践证明并不能达到这一高度。
苏联发出照会后，美方有所收敛，飞机停飞了几个月。1957年初，这个计划又卷土重来。不过，后来的行动更为慎重，注意突出优先目标和选择最佳航线。1957年到1960年，共飞了20次，往苏联的东部地区飞过5次，往西部地区飞过15次。
U-2飞机侦察到了大量情报，光是照片就拍摄了几千张。这些照片显示了苏联的机场、飞机、导弹发射场、特种武器库、港口设施、在建潜艇、核武器生产、兵力部署等方面的情况。
1959年12月中旬，美、苏、英、法四国同时宣布，为了缓和国际紧张局势，1960年5月16日将在巴黎举行首脑会谈。
为了给艾森豪威尔准备一份有关苏联导弹最新情况的材料，杜勒斯再一次命令U-2飞机进行空中侦察。
1960年5月1日，当地时间6点25分，年轻飞行员鲍尔斯驾驶U-2飞机从巴基斯坦的白沙瓦空军基地起飞。飞行到2万米高空时，他用密码和地面站进行了联络，报告“呆板的花花公子68一切正常”。为了保密，他关掉电台，开始了静默飞行。
这次安排的飞行路线，包括苏联的心脏地区——提拉乌顿姆的人造卫星和宇宙飞船发射中心，还要经过斯维尔德洛夫斯克的工业综合基地和普列谢茨克的远程弹道导弹发射场，最后经过阿尔汉格尔斯克和摩尔曼斯克，顺便侦察远程轰炸机和潜艇的情况，以及搜寻这一带是否还有别的军事设施和基地。
飞机进入苏联领空不久，苏联国防部长马林诺夫斯基就用电话向赫鲁晓夫报告说，一架U-2飞机从阿富汗方向入境，正向斯维尔德洛夫斯克飞去。
赫鲁晓夫当即命令，不论用什么手段，务必将此机击落。鲍尔斯驾驶的飞机飞到苏联中部城市斯维尔德洛夫斯克上空时，突然有三架米格战斗机向它扑来，鲍尔斯立即加速。米格战斗机因速度不够，被远远抛在后面。看到这些，鲍尔斯扬扬得意，脸上泛起胜利的微笑。然而就在此时，随着一声巨响，一道红光在他眼前闪过，还没等他反应过来，飞机已失去控制，直线下栽。鲍尔斯明白，飞机被导弹击中了，他慌忙跳伞逃命。虽然命保住了，但是他落入了苏联人之手。
当天，他被苏联当局用飞机押到距斯维尔德洛夫斯克1000多公里的莫斯科，关进了卢比扬卡监狱。
赫鲁晓夫当即决定把这一消息告诉苏联人民，作为向“五一”国际劳动节的献礼。
这天下午3点多钟，美国的侦察部队向华盛顿报告了鲍尔斯失踪的消息。中央情报局的头头们得悉后，一个个惊魂不定，急得如热锅上的蚂蚁。老谋深算的杜勒斯心事重重地说：“我们已在俄国上空飞行了多年，他们的米格战斗机不可能飞到U-2飞机那么高。难道U-2飞机没有飞到2万米的高度吗？”一位粗鲁的美国将军骂道：“我不明白，俄国佬他妈的是怎样打下U-2的！”
U-2飞机事件在美苏两国间闹得沸沸扬扬。美国认定鲍尔斯绝无生还可能，而且飞机从2万米高空坠下也不会留下任何证据。所以，美国坚持说，这是测候飞机中途偏离航线误入苏联领空，企图掩盖真相。然而，赫鲁晓夫请出了鲍尔斯，还公布了这位飞行员诚实的供词，使真相大白。苏联强烈抗议美国的侵略行径，决定取消艾森豪威尔将对苏联的正式访问，使艾森豪威尔狼狈不堪。
U-2飞机被击落，成为杜勒斯心中的一大谜案。直到五年之后，克格勃间谍巴托列斯基叛逃到美国，才揭开了这个谜底。原来，击落U-2飞机的，并不是什么新式武器，它是克格勃精心设计的结果。
1960年4月，克格勃总部接到克里姆林宫的指示，要想尽一切办法，尽快弄一架U-2飞机。克格勃接受任务后，立即行动起来。
第二天，克格勃专管中东地区对外谍报工作的负责人马林斯基便匆匆忙忙地飞到阿富汗首都喀布尔，同克格勃驻喀布尔的负责人密商，要找一个通晓飞机的专门人才。他们选定了一个叫穆罕默德·嘉兹尼·汗的飞行员。他曾在苏联受过训练，驾驶过米格战斗机，熟悉阿富汗和巴基斯坦的情况，很容易混进巴基斯坦。
穆罕默德·嘉兹尼·汗被买通之后，换上破旧的衣服，乘公共汽车来到巴基斯坦的白沙瓦。在那里，他找到了以前的老朋友牟尼伊·汗。穆罕默德请求牟尼伊想办法在机场给自己介绍个差事，最好是军用机场，尤其是美国人的军用机场。牟尼伊·汗听了之后表示，在美国军用机场只能干清洁工、搬运工之类的粗活，摆弄飞机的技术活全由美国人负责。说来凑巧，恰好这时有一名机场清道工因病不能上班，于是穆罕默德冒名顶替，潜入机场。可是，作为清道工，他根本无法接近机库。那里戒备森严，一般的勤杂人员是不许靠近的。
无奈之中，他只好再次求助于牟尼伊。他给了这位朋友一笔重金，牟尼伊挖空心思，终于为他物色到了机场空军食堂的一名侍者。他们买通这名侍者，得到了飞行中队的一些情报。他们了解到这个中队是搞高空侦察飞行的，停在机场的是U-2型飞机，最近正准备做一次远程飞行，驾驶员是鲍尔斯。
时候到了，穆罕默德不能再等待了，他决定冒险去闯一闯。他在夜里偷偷地溜进机场，用红外线望远镜进行观察，发现停机坪虽然灯火通明，但警卫人员每次换岗，都在飞机的右舷，而且离飞机的门较远。这是一个可乘之机。一个大胆的行动计划在他的脑子里形成了。
一天深夜，穆罕默德潜伏在离停机坪较近的地方，此时已近午夜2点。一个刚从街上寻欢作乐回来的美军士兵赶来换岗，显得心不在焉。穆罕默德瞅准这个机会，光着脚，神不知鬼不觉地钻进了飞机驾驶舱。他蜷缩着身子，手在驾驶舱的仪表上摸索着。当摸到高度仪的塑料外罩时，他迅速地拧下右上角的一颗螺丝钉，并换上了一颗自己带来的螺丝钉。这是一颗由克格勃专门制作的特殊螺丝钉，它具有极强的磁性，能够扰乱高度仪，把高度仪的钢质指针牢牢吸住。这样一来，当飞机飞到几千米高空时，高度仪指针接近磁力场，慢慢地会被吸引过去，指向2万米的高度，使飞行员误以为飞机已经到达苏联米格战斗机和防空炮火达不到的高度。就是这样一颗小螺丝钉使得鲍尔斯成了苏联人的俘虏，让杜勒斯与中情局遭受了一次沉重打击。当时，美国也疑惑不解，以为苏联有了什么先进的防空武器。
局长生涯的终结
杜勒斯中央情报局局长生涯的终结，缘于“猪湾”事件。
1959年，卡斯特罗领导古巴人民推翻了美国扶植的巴蒂斯塔政府，成立了古巴共和国。美国在拉美地区推行殖民主义政策的基础被这场反美斗争的胜利动摇了，由此，美国政府视卡斯特罗政权为眼中钉。美国政府不希望自己的“后院”出现一个共产主义国家，因而想尽一切办法搞垮卡斯特罗。这个任务又落到了杜勒斯的中情局身上。在杜勒斯的领导下，中情局以往实施的毒品试验、“阿贾克斯”行动、颠覆阿本斯政权行动、柏林隧道行动、窃取苏共二十大报告行动等，为中情局挣来了无数荣耀。因此，美国政府认为，把古巴问题交给中情局而不是军方，是一个明智的选择，因为它能够在神不知鬼不觉的情况下实现美国政府的战略图谋。
1961年1月19日，肯尼迪就任美国总统。此时，杜勒斯已经策划好了推翻卡斯特罗政权的“猪湾计划”，艾森豪威尔在肯尼迪就任的前一天建议肯尼迪尽快批准中情局实施“猪湾计划”。肯尼迪原本对杜勒斯在中情局的工作就印象不错，因而让杜勒斯留任中情局长。他认真审阅了杜勒斯的关于“猪湾计划”的绝密报告，在和有关人员进行讨论后，批准了中情局的这个计划。
1961年4月17日黎明，1500多名所谓的“爱好自由的流亡者”组成的“古巴旅”从美国迈阿密的中情局秘密训练基地出发，渡海来到古巴南端的海滩猪湾沿岸，实施了登陆行动，企图登陆后在古巴制造内乱，推翻卡斯特罗政府。根据中情局掌握的情报，猪湾是空旷的海滩，无人把守。然而，杜勒斯大大低估了古巴情报部门，并且在战术上犯了一个致命错误，那就是将空军力量集中在一个基地里。
其实，古巴情报部门早已得到了有关这次行动的情报，并向卡斯特罗做了详尽的汇报。古巴军队根据卡斯特罗的命令，做好了对付“古巴旅”的军事准备。当“古巴旅”的第一批入侵者登陆后，古巴军队立即实施反击，原本认为可以一往无前的“古巴旅”被打得措手不及，后续的登陆艇因触礁而无法登岸，肯尼迪在关键时刻又撤销了原计划中的对登陆部队的空中支援。随后，古巴空军又击沉、赶跑了“古巴旅”的补给船只。“古巴旅”在负隅顽抗弹尽粮绝之后只好缴械投降。在交火中，有114名“古巴旅”流亡分子被击毙，1189人被俘。仅仅经过三天的战斗，“古巴旅”便全军覆没。
“猪湾计划”的失败，使杜勒斯遭遇了上任以来的最大一次挫折，他苦心经营多年为中情局挣来的信任与荣誉几乎全部丢光，并直接导致了肯尼迪对中情局进行改组。
1961年9月，杜勒斯被迫引咎辞职。让中情局更受打击的是，随后肯尼迪指定专门委员会对中央情报局进行调查。
虽然杜勒斯的八年中情局长生涯是以引咎辞职这种不太体面的方式结束的，但是他对中央情报局以及美国情报界的贡献是受到肯定的。离职之后的杜勒斯依然通过不同的方式，努力为中央情报局进行宣传和辩护。
1961年11月28日，杜勒斯被肯尼迪总统授予国家安全奖章。1968年，中央情报局兰利总部大楼的前厅竖起了一座杜勒斯的大理石浮雕像。这是中情局首次为在世的前领导人塑像，时年74岁的杜勒斯出席了揭幕仪式并亲自为浮雕揭幕。
