d.玻片边沿附近的干涸不应该混淆为凝集。
（2）试管法。
①在1支标记的干净试管中加入1滴抗血清。
②在第2支标记的试管中加入1滴合适的对照试剂。
③在每支试管中各加1滴3%～5%受检者的红细胞（盐水、血清或血浆）悬液。
④轻轻混合，离心。
⑤轻轻重新悬浮红细胞扣，检查凝集。
⑥结果解释：a.抗D试管出现2+或2+以上的凝集而对照管呈现均匀悬液，是阳性结果。
b.如抗D试管凝集低于2+或1+低于阳性对照，或对照管出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果。c.抗D试管和对照管都是均匀悬液者，是阴性的实验结果。病人的血液可以被解释为Rh阴性，但对献血者必须进一步作变异型D和不完全D型试验，如根据厂家的说明这种抗血清对变异型D和不完全D试验是适用的，那么可以用这同一支试管37℃适当孵育后进行变异型D和不完全D试验。
（3）酶法。
①在标记的干净测试管，阳性对照管，阴性对照管中各加入1滴抗血清。
②测试管中加入3%～5%受检者红细胞悬液1滴，阳性对照加阳性细胞，阴性对照加阴性细胞各1滴。
③各试管中各加1滴1%木瓜酶（或菠萝酶）试剂。
④置37℃，水浴30min。
⑤肉眼观察结果。阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，测定管凝集，即表示受检红细胞上有相应的抗原，不凝集即表示受检者红细胞上没有相应抗原。
（4）抗人球法。
步骤①、②同酶法。
③置37℃，水浴30min。
④大量盐水洗涤细胞3～4次。
⑤最后1次洗涤后，把盐水倾斜干净，吸干试管边缘。
⑥加1～2滴抗人球蛋白血清。
⑦轻轻混合，离心。
⑧轻轻重新悬浮红细胞扣，并观察凝集反应。
⑨如试管为阴性，加入已知的IgG致敏细胞并再次离心，以作为抗人球蛋白程序的对照（不一定都需要做），如发生凝集受检者的阴性试验结果为可靠的。
⑩判读结果。阳性对照凝集，阴性对照不凝集，测定管凝集，即表示受检者红细胞上有相应抗原，不凝集，即表示受检者红细胞上不含有相应的抗原。
5．临床意义。
（1）大多数Rh血型抗体由免疫而产生，如怀孕或输血刺激而致。D抗原具有高免疫原性，它能引起50%～85%接受D阳性血的D阴性受血者产生抗D抗体，抗D抗体在医学中十分重要，因为这种抗体可引起严重的新生儿溶血病和溶血性输血反应。
（2）RhD抗原阴性受血者的输血原则是供受者双方ABO血型相同，还要求RhD抗原阴性。
（3）RhD新生儿溶血病患儿输血或换血原则，ABO血型同患儿相同，Rh血型同母亲相同。
（4）Rh弱D型输血原则，Rh弱D型为供者应视为RhD阳性使用。作为受者应输RhD阴性血。
（5）Rh弱D型妇女与RhD阳性丈夫生育的婴儿可能会产生新生儿溶血病。
（6）Rh弱D型受者血小板输血原则是尽管血小板表面无Rh抗原，但制剂中仍含有一定量的红细胞（可使受血者致敏）故RhD阴性生育期妇女（含女童）应输RhD阴性血小板。
（七）RhD阴性确认实验标准操作规程
1．原理。正常的RhD抗原是有10个外显子决定的至少9个抗原表位组成的嵌合体，如果缺乏或被其他基因错代了其中一种或一种以上的因子时，称为变异型D和不完全D型。
变异型D和不完全D型红细胞带有D抗原与大多数抗D试剂在盐水介质和酶试验不发生凝集，但红细胞和抗D血清一起孵育后，在间接抗人球蛋白实验中均发生凝集。因此，必须进行RhD阴性确认实验排除变异型D和不完全D型的可能。
2．试剂。
（1）抗D试剂：使用适合进行变异型D和不完全D试验的抗D试剂，不是所有抗D血清都适合于变异型D和不完全D试验，因为有的抗D血清和变异型D和不完全D细胞没有可靠地反应性，有的抗D血清含有在抗人球蛋白反应的其他抗体或使用不同厂家或不同批号的抗D血清3～5批。
（2）抗人球蛋白试剂，多特异性抗球蛋白或抗IgG。
（3）IgG致敏红细胞。
（4）3%～5%的受检者红细胞悬液。
3．操作步骤。
（1）取6支小试管，分别标明D1、D2、D3及D1+、D2+、D3+阳性对照管。
（2）D1、D1+两管加入单克隆（IgM+IgG）抗-D混合血型血清试剂各1滴，D2、D2+两管加入单克隆IgG型抗-D标准血清各1滴，D3、D3+量管加入人源IgG型抗-D标准血清各1滴。
（3）D1、D2、D3加3%～5%受检者红细胞悬液各1滴，D1+、D2+、D3+加3%～5%D阳性红细胞悬液各1滴。
（4）将上述6管置37℃水浴中孵育30min。
（5）用生理盐水洗涤3次后加抗人球蛋白试剂，3400r/min1000g离心15～30s，肉眼观察凝集，均阴性者可确认为RhD阴性，任何一管阳性者可怀疑为RhD变异性。
4．注意事项。
（1）阳性对照，取3人O型RhD阳性红细胞混合配成。
（2）每次实验都要设置阳性对照。
（3）若D1、D2、D3均为弱阳性，应做直接抗人球蛋白实验检测患者红细胞是否已被致敏。
（4）IgM型抗-D标准血清初筛≤3+，背景浑浊，均应该做RhD确认试验。
（八）Rh表型分型鉴定标准操作规程
1．原理。根据凝集反应原理，当含有D、E、C、c、e抗原的被测红细胞分别与相应抗D、E、C、c、e（IgG+IgM）混合型血型定型试剂混合时，可导致特异性的抗原抗体反应，出现红细胞凝集现象。
2．试剂。
（1）抗D、抗E、抗C、抗e和抗c（IgG+IgM）抗血清试剂。
（2）生理盐水。
3．仪器：Baso血库专用离心机。
4．操作步骤。
（1）取5支小试管，做好标记，分别加1滴抗D、E、C、e和c（IgG+IgM）混合试剂。
（2）再分别加1滴3%～5%红细胞生理盐水悬液。
（3）混匀，以3400r/min1000g离心15～30s。
（4）轻轻摇动试管，观察凝集情况。
（5）结果判断。
5．注意事项。
（1）如果临床上只要检查是否为RhD阳性还是阴性，只需用抗D血清一种进行鉴别。
如果为阴性，应进一步排除弱D，再作Rh表型分型。
（2）如鉴定结果只与抗D血清凝集，与抗C，抗c，抗E和抗e都不凝集，则受检者为Rh缺失型，以“-D-”表示。
（3）Rh系统假阳性结果分析。
①错拿分型抗血清，为了防止发生这种情况，可用不同颜色的标签区别不同的Rh抗血清。
②试剂中存在其他特异性抗体，可用不同来源的抗血清同时做两份试验。
③多凝集红细胞可与任何人血清发生凝集。
④自身凝集患者，用未洗涤的细胞作试验时，异常蛋白质可引起假阳性结果。
⑤试剂瓶可能被细菌、外来物或其他抗血清所污染。
（4）Rh系统假阴性结果分析。
①拿分型抗血清，每次试验时应细心核对抗血清瓶子上的标签。
②管中漏加抗血清，所以在加入红细胞悬液之前，必须检查试管中有无血清。
③一种特定的抗血清不能和其相应抗原的变异型起反应。
④血清和红细胞间的比例以及温育的温度和时间不正确。
⑤血清保存不妥，试剂中的免疫球蛋白变质。
6．临床意义。基因型的推断有助于人群调查及亲子鉴定，也可用于预测有Rh抗体的妇女，其配偶特定抗原阴性的基因传递给后代的可能。
（九）盐水介质交叉配血试验操作规程
1．原理。人类ABO血型抗体是以天然IgM类血型抗体为主（包括MN、P等血型抗体），这种血型抗体在室温盐水介质中与对应的红细胞抗原相遇，出现红细胞凝集反应，或激活补体，导致红细胞膜损伤，出现溶血。进行交叉配血试验时，观察受血者血清与供血者红细胞以及受血者红细胞与供血者血清之间有无凝集和溶血现象，判断供、受者之间有无ABO血型不相合的情况。
2．标本：受血者不抗凝静脉血2.0ml，供血者交叉管血2.0ml。
3．试剂。
（1）生理盐水。
（2）2％红细胞生理盐水悬液取洗涤后压积红细胞1滴，加入生理盐水8滴，此时是约为10%的红细胞悬液。取此悬液1滴，加入生理盐水5滴，即为2%红细胞生理盐水悬液。
4．仪器：Baso血库专用离心机，显微镜。
5．操作步骤。
（1）取受血者和供血者的血液标本，以3000r/min离心3min，分离上层受、供者血清，并将压积红细胞制成5%受、供者红细胞生理盐水悬液。
（2）受血者血清标记为Ps（patientserum），供血者血清标记为Ds（donorserum）。
（3）受血者2%红细胞生理盐水悬液标记为Pc（patientcell），供血者2%红细胞生理盐水悬液标记为Dc（donercell）。
（4）取2支小试管，分别标明主、次，即主侧配血管和次侧配血管。按表12-8进行交叉配血试验。
（5）混合以1000r/min离心30s。
（6）小心取出试管后，肉眼观察上清液有无溶血现象，再轻轻摇动试管，直至红细胞成为均匀的混悬液。
（7）取载坡片一张，用两根吸管分别从主侧管和次侧管内吸取红细胞悬液1滴于载玻片两侧，用显微镜观察结果。
（8）结果判断：ABO同型配血，主侧和次侧均无溶血及凝集反应表示配血相合，可以输用。任何一侧凝集、溶血或两侧均凝集、溶血为配血不合，禁忌输血。
6．注意事项。
（1）配血前严格查对患者姓名、性别、年龄、科别、床号及血型，确保标本准确无误，同时，要复检受血者和供血者的ABO血型是否相符。
（2）配血试管中发生溶血现象是配血不合，标明有抗原抗体反应，同时还有补体参与，必须高度重视。
329（3）红细胞加入血清以后，立即离心并观察结果，不宜在室温下放置，以免影响试验结果。
（4）观察结果时，如果存在纤维蛋白时，可以去除纤维蛋白块，主要观察混合液中有无凝集。
（5）室温控制在（22±2）℃，防止冷抗体引起凝集反应，影响配血结果的判断。
（6）患者一次接受大量输血（10个以上献血者），则献血者之间亦应进行交叉配血试验。
（7）盐水介质配血试验操作简单，是最常用的配血方法，可以发现最重要的ABO血型不合。但只能检出不相合的IgM类完全抗体，而不能检出IgG类免疫性的不完全抗体。
对有输血史（特别是有过输血反应的患者）、妊娠、免疫性疾病史和器官移植史等患者，必须增加另外一种可以检测IgG类抗体的方法，保证输血安全。
（十）聚凝胺介质交叉配血试验操作规程
1．原理。低离子介质可以促进红细胞和相应抗体的反应，在加入聚凝胺后，带正电荷的聚凝胺可以中和红细胞表面的负电荷，促进红细胞之间互相接近，引起红细胞产生非特异性的凝集反应。如果是由特异性抗原抗体反应引起的凝集，则在加入再悬液时，红细胞凝集不会散开；而非特异性凝集，则会在加入再悬液时散开。
2．试剂。珠海贝索生物技术有限公司生产的凝聚胺介质试剂产品。
套组内容：150T装量（BA-1003）主要成分（1）（LowIonicMediun）1瓶×55ml葡萄糖、EDTA（2Na）（2）ybreneSolution1瓶×7.5mlPolybrene、氯化钠（3）suspendingSolution1瓶×7.5ml柠檬酸钠、葡萄糖3．标本。受血者不抗凝静脉血2.0ml，供血者交叉管血2.0ml。
4．仪器：Baso血库专用离心机，显微镜。
5．操作步骤：
（1）同盐水交叉配血法（1）～（3）步。
（4）取试管2支，标主侧、次侧，主侧管加病人血清（血浆）2滴，加供血者3%～5%红细胞悬液（洗涤或不洗涤均可）1滴，次侧管反之。
（5）各加LIM0.7ml，混合均匀后，再各加Polybrene2滴，并混合均匀。
（6）用血库离心机3400r/min1000g离心1min，然后把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1ml的液体。
（7）轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。
（8）最后加入ResuspendingSolution2滴，轻轻转动试管混合并涂片，显微镜下观察结果：在30s至1min内凝集散开，代表是由Polybrene引起的非特异性聚集，配血结果相合；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血结果不相合。
（9）结果判断：ABO同型配血，主侧和次侧均无溶血及凝集反应表示配血相合，可以输用。任何一侧凝集、溶血或两侧均凝集、溶血为配血不合，禁忌输血。
6．注意事项。
（1）配血前严格查对患者姓名、性别、年龄、科别、床号及血型，确保标本准确无误，同时，要复检受血者和供血者的ABO血型是否相符。
（2）配血试管中发生溶血现象是配血不合，标明有抗原抗体反应，同时还有补体参与，必须高度重视。
（3）观察结果时，如果存在纤维蛋白时，可以去除纤维蛋白块，主要观察混合液中有无凝集。
（4）血清中存在冷凝集素时，可影响配血结果判断。此时可在最后滴加解聚液时，将试管立即放入37℃水浴中，轻轻摇动试管，并在30s内观察结果。
（5）患者一次接受大量输血（10个以上献血者），则献血者之间亦应进行交叉配血试验。
（6）聚凝胺介质交叉配血试验中，可以用EDTA的血浆标本代替血清使用。
（7）聚凝胺是一种抗肝素试剂，若患者血液标本中含有肝素，如血液透析患者，须多加几滴聚凝胺液以中和肝素。
（8）本试剂盒的操作方法也适用于抗体鉴定。
（9）试剂使用前请回复室温再行操作。
（10）加做辅助性抗球蛋白试验，目的是增加检测抗-K的敏感性，对检测其他红细胞抗体无帮助。
（十一）微柱凝胶介质交叉配血试验操作规程
1．原理。将适量献血者红细胞和受血者血清、受血者红细胞和献血者血清加入微柱凝胶孔内，放37℃孵育器中孵育后，如果血清中存在针对红细胞抗原的血型抗体（无论是IgM型或IgG型红细胞血型抗体）时，离心后，发生红细胞凝集，形成红细胞凝集团块，凝胶柱中的凝胶具有分子筛作用，阻止凝集的红细胞下沉，留在凝胶的表面或胶中。如果血清中不存在针对红细胞抗原的血型抗体，经过孵育、离心后，红细胞仍然以单个分散形式存在，沉于微柱凝胶的底部。
2．标本。受血者不抗凝静脉血2.0ml，供血者交叉管血2.0ml。
3．试剂。
（1）0.9%生理盐水。
（2）抗人球蛋白微柱凝胶检测卡。
4．仪器：Dianafuge血库专用卡式离心机，显微镜。
5．操作步骤。
（1）取受血者和供血者的血液标本，以3400r/min1000g离心3min，分离上层受、供者血清，并制成0.8%受、供者红细胞生理盐水悬液。
（2）取出微柱凝胶卡，除去铝箔，分别标明主孔和次孔。
（3）主孔中（主侧）加入50μl0.8%供血者红细胞，50μl受血者血清。
（4）次孔中（次侧）加入50μl0.8%受血者红细胞，50μl供血者血清。
（5）加样后的微柱凝胶卡，置37℃微柱凝胶孵育器中孵育15min。
（6）将微柱凝胶卡置于微柱凝胶离心机内，以1000r/min离心10min。
（7）取出微柱凝胶卡观察结果，并记录。
（8）结果判断。
