①配血不符。主侧和次侧孔内红细胞与相应血清发生凝集，在离心后抗原抗体复合物悬浮在凝胶表面或胶中。
②配血相符。主侧和次侧孔红细胞与相应血清没有凝集，离心后红细胞沉于微柱的底部。
6．注意事项。
（1）微柱凝胶卡必须保存在室温下，试验前，要将微柱凝胶卡空卡放入微柱凝胶离心机中，以1000r/min，离心5min，避免卡中的凝胶在运输途中产生胶质不均匀、胶面不整齐或气泡等。
（2）微柱凝胶介质交叉配血试验，可一次性检出IgM型和IgG型红细胞血型抗体，因此在临床输血实际使用时，可以省去盐水介质交叉配血试验。
（3）不要将微柱凝胶试剂卡长期保存4℃，在此温度下，试剂卡中液体蒸发凝集于封口铝箔下，胶易干涸，应将试剂卡保存在18～22℃。
（4）封口已损坏，管中液体干涸或有气泡的微柱凝胶试剂卡不能使用。
（5）配血标本要新鲜（3d以内），不能被细菌污染，否则会出现假阳性反应。
（6）血清标本必须充分去纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。
（7）微柱凝胶卡中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他因素所致溶血，故对标本一定要认真分析。
（十二）直接抗人球蛋白试验标准操作规程
1．原理。本方法用于检查不完全抗体。不完全抗体在与相应红细胞在盐水介质中结合后不表现凝集反应。这种结合了不完全抗体的红细胞称为致敏红细胞。不完全抗体是球蛋白。致敏红细胞就是被球蛋白包裹的细胞。而人的球蛋白本身又是很好的抗原，可以用来免疫动物，使之产生抗人球蛋白抗体，即抗人蛋白血清，将此血清加入人的致敏红细胞悬液中，由于人球蛋白与抗人球蛋白的特异性结合反应，使红细胞发生凝集。从而显示出不完全抗体的存在。
2．标本：3%～5%待检红细胞悬液2ml。
3．试剂：多特异性抗球蛋白试剂、抗IgG、抗C3d、3%～5%IgG致敏红细胞。
4．仪器：台式离心机、Baso血库专用离心机。
5．操作步骤。
（1）取患者红细胞1滴，用生理盐水洗涤3～4次后配2%～3%红细胞悬液。
（2）取4支试管分别加入多特异性抗球蛋白、抗IgG、抗C3试剂各1滴，然后再各加1滴2%～3%受血者红细胞悬液，混匀。
（3）以3400r/min1000g离心15～30s，持一定的角度轻轻地摇动试管直到松动所有细胞。看到均匀的细胞悬液为阴性，有凝集为阳性。
（4）对照：用IgG致敏细胞（抗-D血清加Rh阳性细胞，37℃水浴30min，洗涤3次配成3%红细胞盐水悬液）作为多抗及单抗IgG的阳性对照，阴性对照用正常人AB血清与正常人“O”型红细胞反应。抗C3阳性对照细胞用1份ACD抗凝新鲜血加9份10%蔗糖，37℃15min，洗涤3次，37℃水浴30min，配成3%的红细胞悬液。阴性对照用正常人“O”型红细胞。
6．注意事项。
（1）标本采集后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞中释放出来。
（2）抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则可产生前带和后带反应而误为阴性结果。
（3）待检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。
（4）红细胞上若吸附抗体较少，自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。
（5）全凝集、冷凝集血液标本或脐血标本Wharton胶，若洗涤不充分，血液标本中会有很多网织红细胞，另外，若抗球蛋白血清中含有抗转铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集。
7．临床意义：阳性结果主要见于下列情况。
（1）温反应性抗体（IgG）引起的自身免疫性溶血性贫血。直接试验呈强阳性。
（2）药物诱发的免疫性溶血性贫血。α-甲基多巴诱发者直接和间接试验均阳性；青霉素诱发者，直接试验阳性，间接试验阴性；喹宁诱发者直接试验多为阴性。
（3）冷凝集素综合证。直接试验阳性，间接试验阴性，试验须在37℃下进行。
（4）新生儿同种免疫溶血病。新生儿的红细胞因Rh抗原致敏者，直接和间接试验均强阳性，持续数周，换血输血后数天内可变成阴性。由ABO血型不合引起的溶血病，此试验常为阴性或弱阳性。
（5）其他。传染性单核细胞增多症、淋巴瘤等直接试验有时阳性。
（十三）不规则抗体筛选与鉴定试验标准操作规程
方法：盐水介质检测法、非盐水介质检测法。
1．原理。让待检者的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套）起反应，以发现在37℃中有反应活性的抗体。这种抗体可引起新生儿溶血病、溶血性输血反应或使输入的红细胞存活期缩短等。当不规则抗体筛选试验阳性后，再进行不规则抗体鉴定，即利用谱红细胞（11套鉴定细胞）与待检者的血清反应，根据反应结果判断机体所产生的同种抗体类别。
2．试剂。
（1）符合国家标准的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号筛选细胞及谱细胞。
（2）生理盐水。
（3）多特异性抗人球蛋白试剂。
（4）聚凝胺试剂。
（5）微柱凝胶卡。
3．仪器：Baso血库专用离心机，Dianafuge血库专用卡式离心机。
4．操作步骤。
（1）取筛选细胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套）和被检者血清在三种介质中（盐水、聚凝胺、抗人球蛋白）反应。
（2）盐水法。
①取4支试管分别标明S1、S2、S3、自身细胞，加入对应5%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套试剂抗筛细胞和患者自身5%的红细胞悬液。
②以3400r/min1000g离心15～30s，持一定的角度轻轻地摇动试管直到松动所有细胞。
看到均匀的细胞悬液为阴性，有凝集为阳性。
（3）抗人球蛋白法。
①取4支试管分别标明S1、S2、S3、自身细胞，加入对应5%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套试剂抗筛细胞和患者自身5%的红细胞悬液。
②将加好的试管置37℃水浴箱孵育30min致敏。
③将孵育好的试管用生理盐水洗涤3次，最后1次历尽管口水滴。
④各管加入1滴多特异性抗球蛋白试剂（IgG+C3d）后以3400r/min1000g离心15～30s，持一定的角度轻轻地摇动试管直到松动所有细胞。看到均匀的细胞悬液为阴性，有凝集为阳性。
（4）聚凝胺法。
①取4支试管分别标明S1、S2、S3、自身细胞，加入对应5%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ套试剂抗筛细胞和患者自身5%的红细胞悬液。
②各加LIM0.7ml，混合均匀后，再各加Polybrene2滴，并混合均匀。
③用血库离心机3400r/min1000g离心30s，然后把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1ml的液体。
④轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。
⑤各加再悬液2滴，轻轻混匀，观察结果。
⑥结果判断：若为非特异性凝集，则会在1min内散开；若为特异性凝集，则不会散开。
可进一步在显微镜下观察有无凝集现象。若不凝集，表示抗体筛选试验阴性；若凝集，为抗体筛选试验阳性。
（5）微柱凝胶法。
①在微柱凝胶卡上标记1、2、3，分别加入1、2、3号筛选红细胞50μl和被检血清25μl。
②将微柱凝胶卡置于微柱凝胶孵育器内，孵育15min。
③将微柱凝胶卡置于微柱凝胶离心机内，以1000r/min离心10min。
④取出微柱凝胶卡观察结果，并记录。
⑤结果判断：抗原抗体复合物浮在微柱凝胶卡表面或胶中，为阳性反应；沉于尖底为阴性反应。
（6）对于抗体筛选试验阳性的患者应检查其抗体的特异性。用谱细胞与被检者血清反应。
①取36支试管分成3排，第排12支试管，做好标记，每支试管加待检者血清2滴。
每排第1～11支试管依次加入1～11号抗体鉴定谱细胞1滴，第12支加待检者2%～5%的红细胞悬液滴。
②第1排试管以3000r/min离心15s，轻轻摇动试管，肉眼观察有无凝集，记录盐水介质反应情况。
③第2排试管中各加入1%的菠萝酶1滴。
④将2、3排24支试管分别置于37℃水浴箱孵育30min。
⑤从水浴箱取出试管，第2排12支试管以3000r/min离心15s，轻轻摇动试管，肉眼观察有无凝集，记录酶反应结果。
⑥第3排试管用生理盐水洗涤3次，各加入抗球蛋白试剂1滴，3000r/min离心15s，轻轻摇动试管，肉眼观察有无凝集，记录抗球蛋白介质反应情况。
⑦实验结果：待检者自身血清加自身红细胞管无凝集；1～11号鉴定谱红细胞管出现±～4+凝集者为阳性结果。根据反应格局，结合待检者红细胞表型分析，可推断抗体特异性。
（7）备注：抗体鉴定中每管所加的血清量视标本总血清量可以有所增减，同时必须留有少量血清以备抗体效价测定使用。
（8）注意事项。
①每种试验必须做自身对照，即待检者自身血清和自身红细胞反应，无凝集则试验有效；若有凝集则提示存在自身免疫抗体。
②抗体筛选阳性后，要用生理盐水洗涤红细胞3次。离心后再观察结果，避免假阳性反应。
③根据反应凝集强度±～4+为阳性凝集结果，表示待检者血清中有不规则抗体，结合谱细胞反应格局，确定抗体特性；无凝集表示待检者血清中无不规则抗体。
④不规则抗体筛选试验在临床输血中是很有价值的，但仍有局限性，其原因有二：一是低频抗原的抗体可能被忽略，二是以往免疫的抗体已降到难以检出的水平。因此抗筛试验不可能检出有临床意义的全部抗体。
⑤不规则抗体筛检，必须对有输血史，妊娠史或短期内需要接受多次输血及交叉配血不合者进行筛检。
⑥不规则抗体筛查的技术要求：尽可能多的检测出有临床意义的抗体；尽可能少的检测出无临床意义的抗体；尽可能快的完成抗体检测。
（9）临床意义。对受血者的血清和血浆，应作常规的抗体筛选试验，以发现有临床意义的不规则抗体。当抗体筛选试验阳性时，让待检血清与谱细胞反应，通过分析待检血清与谱细胞反应格局情况，就可以判断待检者血清中存在不规则抗体的特异性。
不规则抗体筛检有利于早期发现和确认具有临床意义的抗体并可在配血前鉴定此抗体，以获得充足的时间来选择缺乏相应抗原的相配合的供者。以避免因寻找不到相合的血源而延误受血者的治疗。临床上可选择与此相配合的血液供受血者输用。
（十四）吸收放散试验标准操作规程吸收实验
1．原理：当待检细胞加入已知效价的抗A及抗B血清后，若红细胞上有相应的抗原，便可吸收血清中的抗体。再以已知抗原的红细胞来滴定，比较吸收前后抗血清中抗体的效价，便可证明待检红细胞上有无相应抗原以及强度，从而间接判定待检红细胞的血型及其亚型的种类。此方法常用于ABO亚型的鉴定、全凝集或多凝集红细胞的定型以及红细胞血型抗原减弱时的定型等。
2．标本：待检红细胞。
3．试剂：抗A及抗B分型血清、5%A型及B型试剂红细胞。
4．器材：试管、试管架、移液器、台式离心机、恒温水浴箱。
5．操作步骤。
（1）将待检红细胞用盐水洗涤3次，末次洗涤后将盐水倒尽吸干。取1份压积红细胞，与等量抗A血清混合，另取1份与等量抗B血清混合，放置4℃冰箱中至少1h，每10min将试管摇动1次，使红细胞充分吸收抗体，然后离心，上层血清即为吸收液；（2）排列10mm×60mm小试管4排，每排5支，每支各加生理盐水50μl。第1、3两排试管的第1管分别加已吸收抗A及抗B的血清50μl，第2、4两排第1管分别各加未吸收抗A及抗B的血清50μl。然后分别作1∶2～1∶32稀释。
（3）第1、2两排每管各加5%A型红细胞盐水悬液50ul，第3、4两排每管各加5%B型红细胞盐水悬液50μl。
（4）将试管振摇使红细胞充分混匀，放置室温1h（或1000×g离心15～30s），观察凝集反应，记录效价结果。
（5）结果判断。
①吸收后，抗A效价较未吸收抗A效价显着降低或消失者为A型。同理，吸收后抗B效价较未吸收抗B效价显着降低或消失者为B型。如吸收后抗A及抗B效价都显着下降者为AB型。吸收后抗A及抗B效价都无明显差异者为O型；②如试验的目的是鉴定A亚型，则按待检红细胞的吸收强度，即A1>A2>A3>AX>Am规律来判定。
6．注意事项。
（1）试剂中所用的抗A和抗B血清效价不宜过高，应先将抗血清进行标化，一般效价稀释到32或稀释到与检测细胞呈3+凝集反应程度的最大稀释倍数为宜。因为如果抗血清效价太高，抗血清被A亚型细胞吸收后效价下降不明显，难以判断结果（最好用人源抗血清）。
（2）红细胞经洗涤压积后，盐水应尽量去尽，以免抗血清被稀释。
（3）吸收试验的温度，根据抗原、抗体反应的最适温度来决定。ABO系统以4℃为宜，Rh系统以37℃为宜。
冷自身抗体的吸收1．原理：高效价的冷反应自身抗体可能干扰ABO血型鉴定和交叉配血，遮盖同时存在的具有临床意义的同种异体抗体。用自身红细胞在冷环境中可吸收掉这些自身抗体，使同时存在的同种异体抗体可以被检测出来。
2．标本：待检者血标本10ml。
3．试剂：1%半胱氨酸活化的木瓜酶、pH值为7.3的PBS、0.2mol/L的二硫苏糖醇。
4．器材：试管、试管架、移液器、台式离心机、恒温水浴箱。
5．操作步骤。
（1）采一份抗凝标本，置37℃孵育，防止冷抗体吸收到红细胞上。另采一份不抗凝血样，置4℃，让红细胞充分吸收冷自身抗体，然后立即分离血清。
（2）用37℃生理盐水洗涤3次，孵育10min，以上的抗凝血样分置3支试管中，每支约1ml红细胞。
（3）将2ml待见自身血清加入其中1管中，混匀，置4℃孵育30～60min，其间摇动数次，使其充分吸收。
（4）4℃1000×g离心5min，将血清转入第二支有红细胞的试管中，置4℃孵育30min，做第二次吸收。如仍有自身凝集，再做第三次吸收。
（5）结果判断。冷抗体经重复吸收后，应当完全去除，不干扰后续抗体的检测与鉴定。
6．方法评价与注意事项。
（1）一次吸收后，如果冷抗体仍然存在，可多次反复进行自身吸收，直至冷抗体吸收完全。必要时用二期酶法处理自身红细胞后作吸收试验。
（2）自身红细胞如果在吸收细胞前，已经被冷抗体致敏了，此时用ZZAP法或其他不破坏细胞的放散方法先处理自身红细胞再进行吸收，效果会明显提高。
冷自身特异性的测定1．原理：同一般抗体筛选与鉴定。
2．标本：待检血清和血浆5ml。
3．试剂：成人O型I阳性红细胞、病人自身红细胞（如果病人不是O型，选择与ABO血型相同的红细胞，如果病人是A或AB型则需要A1和A2细胞）、用酶处理的O型I阳性红细胞、O型I阴性脐血和（或）成人i红细胞。
4．器材：试管、试管架、移液器、台式离心机、恒温水浴箱。
5．操作步骤。
（1）将血清或血浆用生理盐水倍比稀释从1∶2～1∶4096（12管），稀释体积不应少于1ml。
