《犹大之吻》画作来源于圣经故事。据圣经传说，耶稣的十二使徒之一犹大，偷偷勾结敌人，愿以30块银币出卖他的主耶稣。在逾越节的晚餐上，耶稣告诉他的门徒中将有一个会出卖他。耶稣一指出犹大是卖主之人，他便溜走，并立即去给敌人引路，前来捉拿耶稣。犹大带来了全副武装的士兵闯入园中，按照事先说好的，犹大亲吻了耶稣，以“死亡之吻”做暗号，告诉士兵耶稣的身份。耶稣被带走并被审判，最终被钉死在十字架上。
在这幅画面上，即表现犹大领了一队兵，还有祭司长和法利赛人的差役，手里举着灯笼、火把、兵器冲进了客西马尼园。犹大走在前头，直奔耶稣跟前，要与他亲吻，作为认人的暗号。耶稣当场点破了犹大这一诡计，耶稣的门徒见状大惊。门徒彼得纵身上前，抽刀便砍，当场砍掉了大祭司的仆人马勒古的右耳朵。耶稣双目盯紧犹大，满眼怒火；犹大则十分紧张。四周则充满着骚动，气氛极其悲壮。
《犹大之吻》是选择耶稣的生平中最扣人心弦的一瞬间。画家用戏剧性手法，将矛盾尖锐对立的双方耶稣与犹大置于画面的视觉中心，其余人物分列两旁，作对称式向着中心主体人物，画家以众多人物的复杂场面展开，显然是要借这一题材来表现生活的黑暗与光明面，以期体现正义与邪恶之间尖锐的冲突。在这幅画面上，犹大的身体被明亮醒目的黄色大氅所包裹着，在周围复杂的人群中，犹大的黄色大氅明亮而醒目。犹大抬手紧紧抱住耶稣，要与之亲吻，使大氅形成扇面形的褶纹由疏到密向上集中，将人们的视线引向耶稣和犹大对立的面孔上。耶稣面对即将降临的灾难，无所畏惧，他双目紧紧盯着犹大，目光冷静、锐利，充分体现了对叛徒的仇恨。
耶稣的形象，是作为道德完善的崇高象征来表现的，耶稣是光明、正义的化身。犹大怀着阴险、丑恶、卑鄙的目的，是黑暗、邪恶和丑的化身，反映的是画家自己对正义的同情和对邪恶的憎恨立场。乔托在这幅画上比较深刻地处理了这一宗教情节，全画用重色调，上部深蓝，下部褐色，造成一种沉重的黑暗感，以渲染这种斗争的紧张气氛。
乔托在这幅壁画上开始摆脱了中世纪宗教、神学的控制，那种僵直、教条的神化形象被富有生活气息的世俗人所代替代。在当时，人文主义思想已经萌生，但还未形成一种思想运动，其特点即是与封建正统的神学思想相对立，人们开始从信仰神转变为信仰自己、尊重人性和人生的价值。虽然乔托一生都在力求革新，加强形象的个性化，但还未臻于理想；尽管如此，他的努力是受到伟大诗人但丁的好评的。但丁在他的《神曲》里曾写道：“契马布埃强逞能，自负艺坛最英雄。而今乔托名扬远，竟将先生变后生。”
《犹大之吻》运用一个鲜明的宗教故事作为载体，通过色彩的明暗对比，再一次诠释了故事的精髓，烘托人性的善恶，将其含义形象化，形成强烈的视觉效果，使人产生共鸣。
