4.7.3试验方法：将试验菌点接到平板培养基上，37℃培养过夜。在菌落周围绿色质地上产生一个无色透明环者为阳性。
4.8凝固血清液化试验
4.8.1原理：某些细菌能产生蛋白酶，可使凝固血清液化。
4.8.2吕氏血清培养基：1％葡萄糖肉汤（pH7.6）1份
无菌采取兔（或牛、羊）血清3份
将肉汤与血清按比例混合，分装于无菌试管内，每管5ml，在血清凝固器上，使成一定角度，制成斜面，间歇灭菌3次，第一次80℃lh，第二次85℃lh，于37℃温箱过夜，第三次90℃lh；于37℃过夜，污染的斜面废弃。
4.8.3试验方法。取细菌纯培养物接种在吕氏血清培养基表面，于37℃培养2～7d，可见到菌落下陷，菌落周围液化，即为液化阳性。
4.9氰化钾抑菌试验
4.9.1原理：氰化钾可以和铁卟啉结合，因此，有铁卟啉的酶，如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，与氰化钾结合后，使酶失去活性，而细菌的生长受到抑制。在肠杆菌科中沙门氏菌、志贺氏菌和埃希氏菌等3个属的细菌，氰化钾有抑制生长的作用。
4.9.2培养基：蛋白胨10.0g
氯化钠5.0g
磷酸二氢钾0.225g
磷酸氢二钠5.64g
蒸馏水1000ml
取上述成分加热熔解，调整pH为7.6，121℃灭菌20min，置冰箱内充分冷却后，以无菌操作法加入氰化钾（每1000ml培养基加0.5％氰化钾液20ml，使氰化钾最终浓度为1：1000）分装于无菌试管内，每管lml，用蘸有热石蜡的软木塞塞紧，在4℃下可保存28d，同时要作不加氰化钾的肉汤作对照。
0.5％氰化钾液：取0.5g氰化钾加入无菌的蒸馏水lOOml中混匀即可。
4.9.3试验方法。取幼龄试验菌接种于氰化钾培养基和空白对照培养基，置37℃培养24-48h，观察生长情况。试验菌能在氰化钾培养基上生长，表示氰化钾对试验菌无毒性作用，为阳性。试验菌在氰化钾培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养不适于试验菌的生长，必须选用合适的培养基。若试验菌在空白培养基上生长，在氰化钾培养基上不生长，为阴性。
4.9.4注意事项：氰化钾是剧毒药品，操作时必须非常小心，培养基用完后，每管加几粒硫酸亚铁和0.5ml 20％氢氧化钾溶液去毒，然后才可清洗。
三、细菌运动性检查
有些细菌具有运动能力，可以独立运动；另一些细菌则没有运动能力。在显微镜下观察，细菌的真正运动（自由运动）表现为能离开原来的位置，不断改变方向的自由地游动。水的分子运动（布朗氏运动）也能见于细菌个体，使其在原地摆动，但不能远离原来位置移动；或者由于细菌所在的液体放置不平，发生液体流动，细菌亦随水流方向漂流移动。这两种情况，都是外力作用的结果，不是细菌本身的真正运动。检查细菌运动力，应使用细菌幼龄培养物，最好刚从温箱中取出，并在温暖的环境下尽快进行。
1.直接镜检法
1.1悬滴检查法
1.1.1制片：取洁净凹玻片一块，于其凹窝的四周均匀地涂以适量的凡士林。另取洁净盖玻片一块，如待检细菌为固体培养物，用接种环取1滴生理盐水或透明肉汤滴于盖玻片的中央，再用接种环挑取少量固体培养物，混匀于液滴内；如待检细菌为液体培养物，则可直接用接种环取1滴于盖玻片上；然后翻转盖玻片，使液滴朝下，轻轻盖在凹玻片的凹窝上，略加轻压，使盖玻片四周与凡士林紧密接触，将凹窝封闭并粘牢盖玻片，悬滴样本片即制成。如只作短时问的观察，也可不用凡士林，而是用水将凹玻片的凹窝四周湿润，或甚至水也不用，只盖上盖玻片即可。
1.1.2镜检：将显微镜置于平坦、稳固的显微镜台上，装上悬滴标本片后，先用低倍镜观察，找到液滴后将其移至视野的中央，调整光线后换用高倍镜，一般在高倍镜下即可观察到细菌运动情况。在观察时，必须缩小光圈，适当降低聚光器，以造成一个光线较弱的视野，便于观察。必须使用油镜观察时，应注意防止压碎盖玻片。
1.2.压滴检查法本法主要用于检查浑浊或浓稠的液体病理材料（如血液、脓汁、稀粪、渗出液等）以及固体病理材料中的细菌的运动性。
1.2.1制片：取洁净载玻片一块，于其中央滴1滴生理盐水，再用接种环取少量固体病理材料于液滴中，混合均匀；取盖玻片一块，先将其一边与液滴边缘接触，液滴浸满整个边后将盖玻片徐徐放倒压盖在液滴上，注意避免产生气泡。
1.2.2镜检：同悬滴检查法。
1.3暗视野显微镜检查法亦称为暗视野检查法。
1.3.1制片：方法同压滴检查法，但要选用厚度不超过1.5mm的薄载玻片，否则暗视野聚光器的斜射光交点将落在玻片内，而不能调整于液滴中，这样将看不到标本的影像。
1.3.2镜检：方法基本上同光学显微镜，但应注意以下特点：
①宜采用强光源，一般采用强光灯作光源，否则物像不清晰。
②调节光源，使光线集中在暗视野聚光器上。先用低倍镜观察，移动暗视野聚光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央；如聚光器已调整固定好，可省略此步骤。
③先在聚光器上加1滴香柏油，然后将样本片放在载物台上，上移聚光器，使其上的香柏油与样本片的底面接触，注意中间不能形成气泡。
④在样本片的盖玻片上加1滴香柏油，旋转粗调节螺旋，使镜头浸在香柏油内，边观察边用粗、细调节螺旋调焦，必要时需稍微升降聚光器以调节斜射光交点，使其正好落在样本上，并可调节油镜头的光圈，三者相互配合，直至出现清晰的物像为止。
⑤当被检样本中有细菌存在时，则反射的光线通过镜筒达到目镜，在暗视野中可见到好似闪亮的小玻璃珠样的菌体。
⑥镜检完毕，关灯，将集光器放下，镜头提高，擦镜纸拭去物镜与集光器上的香柏油，其样本片放于消毒液中。
温暖的环境下尽
2.培养检查法
2.1半固体培养基穿刺培养法：用灭菌接种针蘸取纯培养物垂直穿刺接种于半固体培养基的琼脂柱内，置37℃恒温培养箱内培养18～24h后取出观察。有运动性的细菌可沿穿刺线向四周扩散生长，使培养基变浑浊；无运动性的细菌只能沿穿刺线生长，周围的培养基仍保持澄清。
2.2平板挖沟培养法：预先制备好鲜血琼脂平板，以无菌手术在平板中心横过挖去一条1cm宽的琼脂条，使平板中间形成一条小沟，放置一条4cm×0.5cm的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，置37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至7d，如接种端的隔沟对边亦生长出同样细菌，表示该菌有运动力。
四、细菌血清型鉴定
细菌抗原结构比较复杂，有存在于细胞壁的菌体抗原（O抗原），运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原（H抗原），它具有不同的种、型特异性。包围于细胞壁外面的抗原称表面抗原，包括种、型特异性很强的荚膜抗原（如炭疽杆菌）以及Vi抗原（沙门氏菌）和K抗原（大肠杆菌）。此外还有存在于某些革兰氏阴性杆菌表面的菌毛抗原。从抗原的特异性程度可区分为；存在于属问细菌所共有的共同抗原，这种抗原的存在，只能表明其属性。另一类抗原为特异性抗原，只存在于特定的种、型，是最后确定细菌种、型的重要依据。血清型鉴定是微生物鉴定的特异方法。首先要求鉴定的细菌必须纯净，不能混有其他种细菌，而且要新鲜，细菌要在适宜的条件下培养，尽量减少传代，以防发生变异，其次是要有特异性强和效价高的已知标准免疫血清（包括单克隆抗体）和标准菌株。有些种类细菌，如大肠杆菌和沙门氏菌不仅种、型繁多，而且抗原构造复杂，应购置专门的分型血清以备应用。最后是根据其菌体构造和抗原成分以及实验室的设备技术条件，选择相应的一种或几种血清学试验方法进行鉴定。
五、细菌毒力测定
病原性细菌致病能力的强弱程度称为毒力。通常毒力越大，致病性就越强。同一种病原菌，因菌株不同，致病力大小也不相同，有强毒、弱毒和无毒株之分。细菌的毒力测定，在微生物实验研究中特别重要，尤其在疫苗效价、血清效价、细菌毒素的测定、食品毒理研究等，都必须预先将实验用的细菌（或毒素）的毒力加以测定。测定微生物毒力大小系用递减剂量的材料（活的微生物或毒素）进行毒力测定。测定方法系用递减剂量的材料（活的微生物或毒素）感染易感动物来进行。每次试验时，均须注意实验动物的种别、年龄与体重、试验材料和剂量、感染途径以及其他因素。因为这些因素都会直接影响毒力测定结果。其中感染途径与动物体重尤为重要。用来表示微生物毒力大小的单位有最小致死量（M.L.D）或最小感染量（M.L.D）和半数致死量（LD50）或半数感染量（ID50）两种。
最小致死（感染）量：能使特定的动物感染后，在一定时限内发生死亡（感染）的最小的微生物量或毒素量。这一测定毒力的方法比较简便，不过有时可能由于实验动物个体差异而结果有误差。
半数致死（感染）量：在一定的时限内能使半数实验动物发生死亡（感染）所需的微生物量或毒素量。试验时要选择年龄、大小、体重一致的动物，将动物分为若干个组，每组动物数量相等。然后用等量的试验材料感染同一组动物。各组动物所用的试验材料量均有一定差数。对每组动物加以记录，然后用数学方法计算半数致死量。
第四节细菌的药物敏感性鉴定
各种致病菌对不同的抗菌药物（包括抗生素、磺胺类药、呋喃类药、沙星类药和中草药等）的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对同一抗菌药物的敏感性也有差异；同时抗菌药物的使用又可导致抗药菌株的产生或干扰机体内的正常微生物的作用，反而给机体带来不良影响。因此，测定细菌对抗菌药物的敏感性，选用有效的抗菌药物，对养殖生产具有重要意义。
一、药敏测定原理测定抗菌药物在体外对病原微生物的生长有无抑制作用的方法，称为药敏试验，有的以抑制细菌生长为评定结果的标准，有的则以杀灭细菌为标准。
1.稀释法以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列的不同倍数稀释，经培养后观察最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration或MIC）。常用试管法。
2.扩散法将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此，敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成一个抑菌圈。常用纸片法、挖洞法。
稀释法测MIC的对数与从扩散法测得抑菌圈直径之间成直线关系。通过这两种方法相对应地测试一定量的菌株，可以得到一条代表这种关系的回归线，从试验中所得抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度。
二、常用药敏测定方法
1.纸片法纸片法简单易行，出结果快，是生产中常用的药敏试验法。
1.1药敏纸片：购买标准药敏纸片或自制药敏纸片：取直径6mm的无菌滤纸片，浸于一定浓度的抗菌药液中。一般每毫升药液中浸滤纸片100片，浸泡1-2h后干燥备用，药剂维持1～2个月有效。
药名药液配制药液浓度（ug/ml）含药量（ug/片）
青霉素20mg+PH6缓冲液15.5ml，混匀后吸取1ml，200（IU/ml）2
加入PH6缓冲液9ml中混匀
新霉素20mg+PH6缓冲液10ml 200020
杆菌肽20mg+PH6缓冲液10ml 200020
氯霉素20mg+蒸馏水10ml 200020
多粘菌素20mg+蒸馏水10ml 200020
卡那霉素20mg+蒸馏水10ml 200020
双氢链霉素40mg+PH7.8缓冲液13.1ml 200020
土霉素30mg+0.1mol/L盐酸4.67ml+PH3缓冲液10ml 200020
四环素30mg+0.1mol/L盐酸4.67ml+PH3缓冲液10ml 200020
呋喃妥因20mg+纯丙酮10ml 200020
磺胺嘧啶20mg（ml）+蒸馏水9ml 200020
痢特灵20mg+纯丙酮10ml 200020
庆大霉素20mg+蒸馏水10ml 200020
注：①pH3枸橼酸缓冲液：枸橼酸7g、磷酸二氢钠3g、蒸馏水1000ml。
②pH6磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钠8g、蒸馏水1000rid。
③pH7.8磷酸缓冲液：磷酸氢二钾16.73g、磷酸二氢钠O.523g、蒸馏水1000ml。
以上3种缓冲液分别加热将药物溶解后，用pH试纸或pH计测定酸碱度，高压蒸气灭菌。
