3.1.3试验方法：将试验菌先划线后穿刺，37℃培养1～2d，阳性者斜面上有细菌生长，培养基由草绿色转为蓝色。阴性者不见有细菌生长，培养基仍为绿色。
3.2丙二酸钠利用试验
3.2.1原理：当细菌利用丙二酸钠作为惟一的碳酸钠，使培养基变碱，呈蓝色。
3.2.2培养基：酵母浸膏1.Og
硫酸铵[（NH4）2SO4]2.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4）0.6g
磷酸二氢钾（KH2PO4）0.4g
氯化钠2.0g
葡萄糖0.25g
蒸馏水1000ml
l％溴麝香草酚蓝溶液2.5ml
丙二酸钠3.0g
除指示剂外，各成分混合溶解，调整pH值为6.8，加入指示剂，分装试管，115℃灭菌30min。同时设一份不加丙二酸钠的作空白对照。
3.2.3试验方法：将试验菌分别接种丙二酸钠培养基和空白对照培养基，37℃培养1～2d。如测定培养基有细菌生长并变蓝色，表示试验菌可利用丙二酸盐，为阳性反应。如测定培养基未变色，空白对照培养基也不生长，表示此培养基成分不适于试验菌生长，应另选择合适的培养基进行测定。如测定培养基未变色，而空白对照培养基上能生长，则为阴性结果，表示试验菌不利用丙二酸盐。
3.3醋酸钠利用试验
3.3.1原理：某些细菌可以利用铵盐作为惟一的氮源，同时利用醋酸盐作为惟一的碳源时，可在醋酸盐培养基上生长，并分解醋酸盐生成碳酸盐，使培养基变碱。
3.3.2培养基：氯化钠5.0g
硫酸镁0.2g
磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g
醋酸钠2.5g
琼脂15.0g
1％漠麝香草酚蓝溶液8m1
蒸馏水lOOOml
除指示剂和琼脂外，溶解各成分，调整pH值为6.8～7.0，加入琼脂熔化后，再加指示剂，培养基呈草绿色，分装试管，121℃灭菌20min后摆成斜面。亦可制成液体培养基。
3.3.3试验方法：将试验菌接种于斜面培养基或液体培养基中，37℃培养1—2d，若培养基由草绿色转为蓝色者为阳性反应。
3.4马尿酸钠水解试验
3.4.1原理：B群溶血性链球菌有马尿酸钠水解酶，可使马尿酸钠水解为苯甲酸和乙氨酸，而苯甲酸与三氯化铁相结合，形成稳定的有色的苯甲酸铁沉淀。
3.4.2培养基：牛肉汤培养基100ml
马尿酸（Na-hippumte）1.0g
将马尿酸钠溶解于牛肉汤培养基中，分装于小试管内，加塞包好，置121℃蒸气灭菌20min。
3.4.3试剂：氯化高铁（FeCl3·6H2O）12.0g
2％盐酸100ml
混合溶解。
3.4.4试验方法：将试验菌接种于马尿酸钠培养基上，置37℃培养2～4d。取培养物0.8ml，加试剂0.2ml，立刻混合均匀，经10～15min，观察结果，如管内出现经久不消失的褐色沉淀，则表示马尿酸钠已水解为苯甲酸，是阳性反应。
3.5葡萄糖铵利用试验
3.5.1原理：某些细菌可利用铵盐作为惟一的氮源，且不需要尼克酸和某些氨基酸作为生长因子时，可以在此培养基上生长，分解葡萄糖，使培养基变酸，呈黄绿或黄色。
3.5.2培养基：氯化钠5.0g
硫酸镁0.2g
磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g
葡萄糖2.0g
琼脂20.0g
蒸馏水1000ml
1％溴麝香草酚蓝溶液10ml
除琼脂和指示剂外，各成分溶解后，调整pH值为6.8，加人琼脂熔化后，再加入指示剂，分装试管，115℃灭菌20min，放置斜面。
注：容器使用前用清洁液浸泡过，再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性。
3.5.3试验方法：用接种环蘸取少量试验菌，在生理盐水管做极稀的菌悬液。将接种环灭菌，再挑取菌悬液少许接种，同时再以同法接种普通琼脂斜面一支作为对照。37℃培养24h。若试验管斜面上有正常大小菌落生长，培养基变黄者为阳性反应；阴性者无菌生长；对照培养基上生长良好。
3.6有机酸盐利用试验
3.6.1原理：酒石酸受细菌酶的作用，分解为乙酸、草酸等比较简单的有机酸。枸橼酸通过三羧酸循环，可被分解为各种比较简单的有机酸，如琥珀酸、乳酸、乙酸等。这些有机酸的生成，可使pH值下降，指示剂颜色由蓝变黄，甚至变白。同时未被分解的酒石酸和枸橼酸与铅离子形成铅盐沉淀，若与阴性对照相比，可以判定反应的程度。细菌对酒石酸异构体的分解具有特异性。黏液酸分解后，可以生成简单的有机酸，用指示剂指示出酸性反应。
3.6.2培养基：蛋白胨10.0g
0.1moL/L NaOH 8.5g
蒸馏水1000ml
1％右旋酒石酸钠2.0g
0.5％左旋酒石酸1.0g
0.5％消旋酒石酸1.0g
1％枸橼酸钠2.0g
l％黏液酸2.0g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液12ml（分成5份）
另备5mol的NaOH若干毫升。
取前3种成分混合，加热熔解，分成5份，每份200ml，分别加入以下各试剂1种，待熔解后，分别以5mol/L的NaOH调整到pH7.4。按规定量加指示剂，分装，每管3～4ml，在121℃灭菌20min，置冰箱内备用。
3.6.3试验方法：用接种环由20h的肉汤培养物接种到有机酸培养基上，置37℃培养14d，每天观察记录颜色变化。能分解酒石酸、枸橼酸、黏液酸者，指示剂由蓝变黄绿，直至白色，阴性者仍为蓝色。
在试验结束时，向酒石酸盐、枸橼酸盐管内加0.5ml的醋酸铅饱和水溶液，阳性管只有少量沉淀，阴性管有大量铅盐沉淀，24h后约占2/3液柱高度，与对照管相同。
4.酶类试验及其他试验
4.1氧化酶试验
4.1.1原理：氧化酶即细胞色素氧化酶，在有分子氧和细胞色素C存在时，可氧化盐酸二甲基对苯二胺产生红色反应。若加等量a-萘酚酒精溶液，则形成吲哚酚蓝，出现蓝色反应。
4.1.2试剂：l％盐酸二甲基对苯二胺（或盐酸四甲基对苯二胺）水溶液（装于棕色瓶中在冰箱中贮存）。1％a-萘酚酒精（95％）溶液。
4.1.3试验方法：A.取一张白色滤纸条，滴上1％盐酸二甲基对苯二胺水溶液，以湿润为宜。用细玻棒（或牙签）沾取幼龄试验菌，涂抹在滤纸条上，10s内出现红色者为氧化酶试验阳性。B.用1％盐酸二甲基对苯二胺液湿润滤纸条后，再加等量的1％a-萘酚酒精溶液，然后再涂抹试验菌，10s内出现蓝色者为阳性。取质量较好的滤纸，先剪成约lcm宽的滤纸条，浸泡在1％盐酸二甲基对苯二胺试剂中（或加等量的1％a-萘酚酒精溶液），在室温下风干，放在带橡皮塞的大试管中，置冰箱中保存数月。使用方法同上。
4.1.4注意事项：A.1%盐酸二甲基对苯二胺溶易氧化，应保存在棕色瓶中，贮存于4℃冰箱中，若溶液变红褐色，不宜使用。B.本试验避免含铁物质。遇铁物质催化盐酸二甲基对苯二胺呈红色反应，造成假阳性，故用细玻棒（或牙签）挑取试验菌。C.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸条为宜，如滤纸过湿，会纺碍空气与试验菌接触，而延长了反应时间，造成假阴性。
4.2过氧化氢（触酶试验）
4.2.1原理：有些细菌具有触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。
4.2.2试剂：3％过氧化氢（H2O2）溶液，临用时配制.
4.2.3试验方法：A.取干净的载玻片，在上面滴l滴3％过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试验菌，在过氧化氢溶液中混匀，若有气泡出现则为阳性，无气泡产生者为阴性。B.取3%过氧化氢溶液2ml加入干净的小试管中，用细玻棒沾取试验菌，插入过氧化氢液面下，若有气泡产生者为阳性。
4.2.4注意事项：因为过氧化氢酶是以正铁血红素作为辅基的酶，所以试验菌不应培养在含有血液的培养基上生长，因为这种培基上生长的细菌易产生假阳性反应。
4.3硝酸盐还原试验
4.3.1原理：某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成对重氮苯磺酸，再与a-萘胺偶氮苯磺酸，呈红色反应。
4.3.2硝酸盐培养基：蛋白胨5.0g
硝酸钾0.2g
蒸馏水1000mL
混合上述成分，加热熔解，调整pH值至7.4，分装试管，121℃蒸气灭菌20min备用。
4.3.3厌氧菌硝酸盐培养基：硝酸钾1.0g
磷酸氢二钠2.0g
蛋白胨20.0g
葡萄糖1.0g
琼脂3.0g
蒸馏水1000ml
取上述成分混合，加热熔解，调整pH值为7.2，过滤、分装，121℃蒸气灭菌20min备用。
4.3.4试剂：甲液：对氨基苯磺酸0.8g
5mol醋酸100ml
乙液：a-萘胺0.5g
5mol醋酸100ml
二苯胺试剂：二苯胺0.5g
浓硫酸100ml
蒸馏水20ml
先将二苯胺溶于浓硫酸中，再用蒸馏水稀释。
4.3.5试验方法：将试验菌接种于硝酸盐培养基中，同时设不接种的对照管，于37℃培养3—4d。用两支干净小试管，每天取培养液少许放入试管中，再各滴1滴甲液和乙液，对照管同样加试剂。若试验管菌液呈现红色、橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加1、2滴二苯胺试剂。若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝盐已被还原成其他物质，仍应按硝酸盐还原试验阳性反应（还原能力强的细菌，可把硝酸盐全部还原成氮）。
4.4卵磷脂酶试验
4.4.1原理：某些细菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂生成脂肪和水溶性的磷脂胆碱，使卵黄发生浑浊现象。
4.4.2培养基。取新鲜鸡蛋，冲洗干净，浸泡在75％酒精15～20min，用无菌纱布擦干。无菌操作打开蛋壳，将蛋黄和蛋白分开，蛋黄盛于含有无菌玻璃珠的三角烧瓶中，加入等量的灭菌生理盐水，用力振摇，制成卵黄悬液。取10ml卵黄液加到已熔化、冷却到50％的200ml营养琼脂中，倾注平板，过夜后使用。或取5ml卵黄液加入灭菌的100ml营养肉汤中，混匀分装无菌试管，制卵黄液肉汤管。
4.4.3试验方法。试验菌点种在卵黄琼脂平板上，每皿可点种3～4株菌。37~C培养24～48h观察，如在菌落周围形成乳白色混浊环者为阳性反应。若试验菌为厌氧菌，则需要点种上面加盖无菌玻片或进行厌氧培养。
4.5磷酸酶试验
4.5.1原理。许多细菌有磷酸酶。它可以使磷酸酯水解。本试验主要用于致病性葡萄球菌与其他葡萄球菌的鉴别，以及沙雷氏菌属与肠杆菌的鉴别。
4.5.2培养基：营养琼脂（pH7.2～7.4）100ml
1％磷酸酚酞溶液lml
取营养琼脂熔化并冷却至50％时，再加入过滤除菌的1％磷酸酚酞溶液，摇匀制成平板。
4.5.3试验方法。将试验菌接种在上述培养基上，37℃培养24h后，打开平板，使培养基表面向下，用浓氨水熏片刻，如有酚酞释出，则菌落变为粉红色，即为阳性反应，否则为阴性。
4.6血浆凝固酶试验
4.6.1原理：病原性葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变成不溶解性的纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块，因而有对抗吞噬的作用。凝固酶试验对于判断菌株是否具有致病力很有帮助。葡萄球菌所产生的凝固酶有两种，一种是与细胞壁结合的结合凝固酶，它直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使其发生沉淀，包围于细胞外面凝聚成块，玻片试验的阳性结果就是由此酶引起的。另一种由菌体生成后释放于培养基中，叫做游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶，试管法阳性和其有关系。
4.6.2试验方法：A.载玻片法载玻片一端用蜡笔划直径约1.5cm的圆圈，加生理盐水1滴，挑取菌落浮悬于盐水中，混合均匀，使浑浊似乳后滴加兔（或人）血浆1滴，充分混匀近lmin；玻片另一端以血浆和盐水作对照。有细菌的血浆出现凝块而对照无，为凝固酶阳性；二者均无凝块者为阴性。血浆制备取无菌兔血（或人血）立即与1/5的抗凝剂（0.1％肝素或5％柠檬酸钠）混匀，以1500—3000r/min离心15min，取上清液（下为红细胞等）即为血浆，以新鲜制备为宜。保存于冰箱中的，要经过试验有效才用。B.试管法将新鲜的兔或人血浆用生理盐水作1：4稀释，取0.5ml置于小试管中，挑取几个培养24h的菌落混悬于内使成浓厚的悬液，并用已知阳性菌作对照，共置于37℃水浴中4～6h，每半小时观察1次，全部或部分凝固者为阳性。
4.7DNA分解试验
4.7.1原理：有些革兰氏阳性细菌，产生DNA酶，分解培养基中的DNA，形成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸，而长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链可溶于酸，在菌落周围形成透明环。
4.7.2培养基：胰酪蛋白胨1.5g
氯化钠0.5g
琼脂1.5g
0.5％甲基绿（经氯仿提纯）lml
O.2mol/L tris pH7.0100ml
各成分混合后，经121℃20min灭菌，取出冷却至500℃左右，加入DNA（1.0g溶于无菌蒸馏水lOOml）lOml倾注平板。
