2.阳离子稳定性试验某些病毒如肠道病毒和呼肠孤病毒可被高浓度二价阳离子如MgCl2所稳定，使其在50℃60min不被灭活。也有另外一些病毒如腺病毒，疱疹病毒和痘病毒反而使其增加对热的敏感性。
方法：将病毒悬液用1.0mol/L MgCl2作10倍稀释，对照管病毒悬液用双蒸馏水作同样稀释。置50℃水浴lh。然后进行毒价滴定，比较两组的差异结果判定同热敏试验。
3.酸敏感性试验本试验系指某些病毒（口蹄疫病毒）在pH3.0溶液中作用30min，可使其感染力降低，而对另一些病毒（猪水泡病病毒）则没有作用。
方法：取1份病毒悬液加9份pH3.0的Hank，s液；另取1份病毒悬液加9份pH7.2的Hank，s液作对照，置25℃下作用2h。作用后试验组用0.1mol/LNaOH调节其pH7.2。然后对试验组和对照组进行毒价滴定，比较两组的差别，结果判定与热敏试验相同。
4.胰蛋白酶敏感试验某些病毒如肠道病毒、冠状病毒和轮状病毒等对胰蛋白酶有较强的抵抗力，而另一些病毒如疱疹病毒和痘病毒等则对胰蛋白酶敏感。
方法：首先用pH7.4的PBS将胰蛋白酶配制成1％溶液，过滤除菌。病毒悬液用3000r/min离心30min，取其上清液加等量1％胰酶溶液充分混合。另取同样的病毒悬液加等量PBS混合，处理方法与试验组相同作为对照。置37℃lh，试验组加4倍量犊牛血清，以终止胰酶的作用。然后对两组分别滴定毒价，比较两组的差异。结果判定标准与热敏试验相同。
5.病毒类脂的测定大多数有囊膜的病毒对脂溶剂有敏感性，病毒囊膜或核衣壳上的主要类脂经脂溶剂除去后病毒即失去感染力。
5.1氯仿敏感试验：于1ml病毒悬液中加等量氯仿（AR），于另lml病毒悬液内加等量的Hank，s液作为对照，在室温下间歇振荡lOmin。悬液经2000r/min离心沉淀5min，使氯仿沉于管底。吸取上层液和对照病毒液分别进行毒价滴定，比较两组差异，结果判定同热敏试验。
5.2乙醚敏感试验：取4份病毒悬液加l份乙醚充分混合，将瓶盖塞紧，置4℃冰箱内过夜。混合液经2500r/min离心20min。用移液管插到乙醚下吸取病毒悬液，滴定病毒的感染力。
5.3脱氧胆酸钠敏感试验：首先用0.75％牛血清白蛋白溶液配制0.2％脱氧胆酸钠，于4℃贮存，用前加温至37℃。病毒悬液以5000r/min离心沉淀lh。取病毒澄清液与脱氧胆酸钠溶液等量混合，同时将病毒澄清液与营养液等量混合作为对照。混合后，用pH7.0PBS在40℃下透析24h，其问换液3次，以去除对细胞有毒的脱氧胆酸钠。通过毒价滴定，比较两组差异，结果判定同热敏试验。
注：在进行本试验时必须设立对脂溶剂敏感和不敏感的两种病毒作为对照。
三、电子显微镜检查
电子显微镜的光原是电子射线形成的电子束，随着加速电压的提高，波长进一步缩短，与普通光学显微镜用的可见光的波长相比，缩短了数万至数十万倍，即把物体放大数十万倍，再加上光学放大，则可达数百万倍。因此电子显微镜技术为研究细胞和各种微生物特别是病毒的超微结构和形态提供了有利的工具。
这里仅就超薄切片技术和负染方法作一概要介绍。
1.超薄切片技术：超薄切片主要用于电镜下观察感染细胞内的病毒形态和存在部位。超薄切片的厚度只有0.01～0.1um，需用特殊专用的切片机才能制备。超薄切片的制备程序基本包括如下五个方面：
1.1标本样品的采集和固定：样品必须采自活体，从采集到固定应在2-3min内完成，最长不可超过5min。死亡动物的组织绝对不能应用，因为死后细胞内各种酶的活动导致细胞自溶，使细胞的结构遭受破坏。固定前将样品剪成小于1mm3的小块，投入2.5％戊二醛溶液中初步固定约0.5～2h，随即用PBS充分冲洗；再投入1％四氧化锇液中作进一步固定约1h，之后再用PBS充分冲洗。
1.2脱水：常用的脱水剂为丙酮和乙醇。脱水时需从低浓度到高浓度，逐步过渡。通常由50％浓度的水溶液开始，逐级经70％、90％、100％和100五次脱水，每次15min。
1.3包埋：包括样品的包埋剂浸透和聚合两道程序。常用的包埋剂主要有环氧树脂、聚酯树脂和甲基丙烯酸酯三大类，其中以环氧树脂为好。包埋时通常先把样品投人脱水剂和包埋剂1：1混合液中过渡一次，然后再用纯包埋剂置换；也可将样品直接投人包埋剂中30-60min。包埋剂的浸透必须完全。聚合是使已浸透包埋剂的样品固化，通常将样品放于60-70℃干烤箱中24-48h，即可完成固化过程。
1.4切片：在进行切片前需准备好直径约2～3mm，网目200～300个的载网（多系铜网）。制膜（载体）常用0.2％～0.3％聚乙烯醇缩甲醛的三氯甲烷溶液，配制后贮于冰箱备用。修整固化的组织块，修整成梯形、正方形或长方形，边长约0.1mm，顶、底两边必须平行，以便形成连续切片带。将修整好的标本块夹在标本夹上，于特殊专用切片机上进行切片。收集切片时，应注意在荧光灯照射下因不同厚度的切片形成不同的干涉色：暗灰色为400nm以下，灰色为400～500nm，银色为500～700nm，金黄色为700～900nm，紫色为900nm以上。超过700nm的切片太厚不易观察。通常选500nm以下的切片制成供透射电镜检查的切片。为此用细玻璃针根据切片的干涉色把500nm以下的拨在一起，把500nm以上的切片挑掉。然后用带有聚乙烯醇缩甲醛膜一面的铜网，在水槽上蘸取切片，以将铜网插入水槽后向上提的方法使切片贴于膜上。
1.5染色：切片制备好后即可进行染色，一般常用1％～3％饱和醋酸铀的50％～70％乙醇或丙酮溶液，也可与柠檬酸铅染液配合使用做双染色。
2.负染技术负染又称阴性反差染色。此法快速、简单，用于检测细胞外游离的病毒，特别适用于难于培养的病毒。负染标本的电镜检查，当今在医学和兽医学临诊上，对某些形态特征明显的病毒如疱疹病毒、轮状病毒、冠状病毒、痘病毒和细小病毒等所致的传染病，结合临床症状和流行病学资料，常常可以做出快速初步诊断或确诊，从而拓宽了电镜应用范围。但由于应用此法检测的样品中病毒浓度必须不低于107/ml时，才能获得阳性结果，因而它的使用还是受到一定的限制。
负染溶液通常用2％磷钨酸钠水溶液，以lmol/L KOH液调整pH至6.8～7.0。滤过除菌后密封保存于4℃可长期使用。
待检样品要尽可能纯净，最好是先经初步纯化的病毒悬液。如粪便或组织块可加适量缓冲液制成匀浆，以3000r/min离心沉淀30min，去除杂质后用上清液制片。水疱液、气管洗涤液和脑脊髓液等，同样经上述离心沉淀后用上清液制片。感染的细胞培养物先经反复冻融3次，使病毒粒子释出，用上法同样离心后用上清液制片。在检查能抵抗有机溶剂的病毒（如细小病毒、轮状病毒）患畜的粪便时，为了提高检出率，可按粪便1：1容量加人氯仿或乙醚，充分振荡lOmin，再按上述离心沉淀20min，取水相上清液制片。为了提高病毒浓度，增加检出机会可将上述制片用的上清液作超速离心的沉淀后，弃上清，将沉淀悬浮于少量缓冲液后制片镜检。
负染色分悬滴法和喷雾法两种，仅介绍操作简便而又常用的悬滴法。用毛细管吸取少量待检病毒悬液，滴加在有支持膜的铜网上，使附着在表面上的悬液呈半球形，静置2～3min后，用滤纸从一侧网边吸去多余的液体。稍干后取一支毛细管吸1滴2％磷钨酸染液滴在网上，染色约0.5～lmin，再用滤纸吸去染液后，立即做电镜观察。
3.病毒的电镜凝集试验本试验属于免疫技术与电镜技术相结合的免疫电镜技术之一。它的原理与细菌凝集试验的相同，只是借助电镜的高倍扩大，使与相应抗体作用下发生凝集的病毒粒子成为电镜下可见的抗原-抗体复合物（凝集物）。由于方法简单易行，结果确实可靠，因而这项技术近年来已发展成为常规的检验手段，它不仅可用于某些病毒性疾病的诊断，而且还可用于病毒的分型鉴定。病毒电镜凝集试验用的病毒悬液，主要是病毒细胞培养液，也可直接用临床病料，如含有大量病毒的粪便或组织等，但都必须先作适当纯化和浓缩。悬液中的病毒纯度和浓度，直接关系到试验结果。有关细胞培养病毒悬液的处理，可参看负染技术。
将超速离心沉淀的病毒悬于适量的生理盐水中，取1滴病毒悬液和适当稀血的抗血清1滴相混合，放4℃过夜，次日即可按上述方法进行负染和电镜检查。凝集反应阳性，可见到病毒粒子凝集成团，但由于病毒间存在抗体分子，使病毒粒子之间有一定距离。
第五节病毒实验室的安全措施
任何从事病原微生物研究或怀疑与病原微生物接触过的人员都面临自己被感染的危险，同时也存在着将病原传播外界的可能。所以有必要制定实验室安全措施。
一、病毒实验室基本安全措施
1.所有污染物，如吸管、针头、注射器等要作明显的标记，在洗涤和处理前要高压消毒，证实无感染性的液体才允许倒人下水道。
2.工作现场要常备基本消毒药，如甲醛和70％的酒精。
3.与感染动物接触的人员要特别注意穿戴专用工作衣，装载感染动物的笼具及食槽在使用完后要充分消毒，感染的动物尸体、组织、鸡胚等要人焚化炉处理。
注：要尽可能地使用高压或蒸气加热消毒，这是最有效的消毒方法。空气和环境消毒可采用紫外线消毒或甲醛熏蒸消毒。如果可能，实验人员要接种针对专项病毒的疫苗。
二、病毒实验室安全守则
1.盛装病毒的容器，使用后立即盖紧盖子。
2.不允许使用嘴吸吸管，所有病毒稀释或接种应使用取液器或吸球吸管，用过的污染头、吸管应立即投入消毒剂中。
3.不能把污染的吸头、吸管等放在实验台面上，不允许拿着污染物或带着可能污染的防护手套到处走动，不允许将含病毒的液体倒入水池中。
4.实验室内不允许吃喝东西和抽烟，不能用实验室内的冰箱和橱柜存放食品和饮料。
5.工作结束要用消毒药充分消毒工作台。
6.离开实验室要脱下工作衣，洗手。
