3.3待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB贮存液使终浓度达0.5mg/ml；
3.4在距离胶模底板0.5～lmm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度为3～5mm，注意避免产生气泡；
3.5凝胶完全凝固后，移去梳子和透明胶，将凝胶放人电泳槽。加入TBE缓冲液使恰好过胶面约lmm；
3.6将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；
3.7接通电源，使样品槽在负极端，用1～5V/cm的电压，电泳适当时间；3.8电泳结束后，可将含EB的凝胶直接放在紫外线检测仪上观察，并拍照记录，也可将不含EB的凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30～45min，再如上观察和拍照，记录结果。
4.凝胶摄影需配置135照相机，全色135胶卷，照相机固定架，近摄镜和红色滤光镜以及有机玻璃防护面罩。操作需在暗室进行，将相机固定好，把凝胶放在紫外检测仪上适当位置，调焦，装上红色滤光片，按常规拍照。亦可使用凝胶自动处理系统，但仪器费用较高。
5.注意事项
EB溶液的净化处理由于EB具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。
5.1对于EB含量大于0.5ug/ml的溶液，可如下处理：
5.1.1将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5ug/ml；
5.1.2加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；
5.1.3加入一倍体积的25mol/L NaOH，混匀并废弃。
5.2EB含量小于0.5g/ml的溶液可如下处理：
5.2.1按lmg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置lh；
5.2.2用滤纸过滤并将活性炭与滤纸密封后丢弃。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
1.原理聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N，N，N，‘N’-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵以及交联剂N，N-亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰受单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例，可改变聚合物的交联度。聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨率高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于lkb的DNA片段。根据所要分离的核酸片段大小，可制备不同浓度的凝胶。
2.凝胶的制备和电泳由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应，灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下，仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触，从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。
2.1材料与方法
2.1.1试剂配制：
①30％丙烯酰胺100ml双蒸水中含29g丙烯酰胺和lg N，N-亚甲双丙烯酰胺。
②5×TBE 每升溶液含54g Tris.HCI，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA
（pH8.0）。
③10％过硫酸铵10ml双蒸水中含1g过硫酸铵。
2.1.2凝胶的制备和电泳操作：
①将玻璃和垫条事先用去污剂刷洗，并经自来水和无离子水冲洗干净，晾干。装置时，将较大的玻璃板平放在工作台上，将两个垫条放在玻璃板两侧，涂上少量凡士林，并将上层玻璃板置于垫条上，用夹子将玻板连同垫条夹紧，底部用1％琼脂糖密封。为防止漏胶，除放梳子一边外，其余三边用防水胶带密封；②根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量，计算配制溶液（100m1）。将35ul TEMED加人100ml混合液中，混匀，然后均匀连续注入两玻璃板空隙中；③立即插入电泳梳，勿使梳齿下形成气泡；④室温聚合1h，梳齿下出现折光带时，表明聚合反应已经完成。若凝胶不立即使用，可用纱布或滤纸（用1×TBE浸泡）包盖于凝胶顶部，置4℃保存1～2d；⑤拔掉梳子，立即用水冲洗加样孔；⑥除去底部胶带，将凝胶直立放入电泳槽。在上下两槽中灌好1×TBE溶液，驱尽凝胶底部附着的气泡。并用1×TBE溶液冲洗加样孔；⑦将核酸样品与适量6×凝胶加样缓冲液混合，并加入凝胶加样孔中；⑧接通电源，正极与下槽连接。电压一般控制在1.8V/cm。电压过高时凝胶产生的热量可造成DNA区带弯曲，甚至引起小DNA片段的解链；⑨电泳毕，取下玻板和凝胶，放在工作台上，从夹层一角轻撬，将上面的玻板轻轻移开，并小心揭下凝胶，置染色液中染色并进行结果观察。
2.1.3凝胶的染色和观察：聚丙烯酰胺凝胶中核酸带的染色，常用溴化乙锭法和银染法。前者与琼脂糖凝胶的染色方法相同。银染法的灵敏度较高，可如下操作：①将凝胶置固定液（10％乙醇、0.5％冰醋酸）中固定10min；②双蒸水洗1～2次；③置0.01mol/L AgNO3溶液中，室温反应15～30min；④充分水洗；⑤置NaOH-甲醛混合液（200ml 3％NaOH，含lml甲醛）中反应至条带显色清晰，本底适宜；⑥用5％冰醋酸终止反应。
第五节免疫印迹技术
一、基本原理免疫印迹又称Westem blot，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相载体（通常为NC 膜），然后用探针检测特异性组分。不同的是，Westem blot所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨率高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blot广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
二、基本方法先将待检测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离各组分，然后通过印迹技术把分离样品几乎原位、定量转移到NC膜上。随后进行类似间接ELISA法测抗原的反应，即用特异抗体与NC膜上的靶抗原反应，结合上的抗体可用与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白进行反应，最后通过与酶的底物发生显色反应来做检测。
实际操作时，常把印迹后的NC膜分成两部分，一部分如上所述做免疫检测，另一部分直接进行蛋白质染色，以便对转移情况做直接观察和判断待测抗原所处位置及推算其分子量。操作方法具体如下：
1.样品的制备样品制备方法的选择取决于样品的类型和待测抗原的性质。细菌样品一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。哺乳动物组织通常可机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。组织培养的单层细胞可用去污剂温和裂解，也可直接在SDS凝胶加样缓冲液中裂解。制备好的样品用做SDS-PAGE分析。
2.蛋白质的SDS-PAGE分析PAGE过程有三种物理效应可使样品分离开来，包括样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应、一般电泳的电荷效应。因此，样品分离效果好，分辨率高。而SDS-PAGE是将强阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）与还原剂巯基乙醇并有，并通过加热，使蛋白质解离成多肽后再加样于电泳凝胶上。由于各种SDS一多肽复合物均带负电，且形状近似，因此，该复合在电场中的迁移率只取决于蛋白质的大小，这样通过SDS-PAGE可将不同大小的蛋白质样品分离开来，借助已知分子量的标准参照物，可推算出相应的分子量。
3.将蛋白质从凝胶转移到NC膜上操作方法如下：
3.1剪6块精细滤纸，一块NC膜（大小应与凝胶一致），并在转移缓冲液（48mmol/L Tris·HCl，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS）中浸泡3～5min；
3.2将转移电泳槽塑料支架平放，依次置放海绵、3块滤纸、NC膜、凝胶及另外3块滤纸和海绵，放置过程注意驱除夹层间气泡。用支架夹紧上述各层，置电转移槽中，NC膜一侧靠正极，凝胶一侧靠负极；
3.3接通电源，40V、约1.6A转移1.5～6h。转移时间长短依靶蛋白分子量大小来调节；
3.4转移结束，取出NC膜做好上、下端标记，切下一条做蛋白质染色处理，以检查转移效果；
3.5将NC膜置于干净滤纸上，室温自然干燥。
4.封闭：这一步处理的目的在于封闭NC膜上一些非特异性蛋白质的潜在结合位点，以避免非特异性反应。通常是在PBS缓冲液中加人1％的脱脂奶粉或牛血清蛋白配成封闭液，并将NC膜浸泡其中，室温封闭1h左右。
5.免疫检测和显色反应包括NC膜与第一抗体、酶标抗抗体（即第二抗体）反应，以及用酶相应的底物处理进行显色反应：
5.1将封闭好的NC膜浸人第一抗体溶液中，抗体液以0.2ml／Cm2调节用量，室温或37℃温和振荡反应1～2h；
5.2弃去抗体液，用PBS洗涤；
5.3将NC膜浸入酶标第二抗体反应液，用量与一抗相同，37℃或室温振荡1～2h；
5.4弃二抗反应液，PBS洗涤；
5.5将膜放人相应显色液中，观察显色反应。阳性反应将在靶蛋白相对应的位置上出现有颜色的条带，而其余位置无显色条带出现。
三、免疫印迹技术的应用实例
用免疫印迹技术可定性、定量地检测出待检样品中含量很低的特定病原体的抗原成分。对于一些能感染细胞而细胞病变不易观察的病原体的检测也很有用。用单克隆抗体作为第一抗体进行免疫印迹，还可以对病毒做分型研究。
1990年，西班牙等一些发现有非洲猪瘟的国家已将ELISA结合Western blot技术广泛应用于非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体的检测以帮助实施ASFV扑灭计划。先用ELISA技术对大批血清样品进行初筛，随后用Western blot技术对阳性样品进一步做验证，可有效排除假阳性反应。1995年，Alcaraz C等应用基因工程技术成功建立了特异性更为理想的重组Western blot技术。他们用大肠杆菌系统克隆并表达了ASFV抗原性病毒结构蛋白p54，将重组p54作为抗原建立了Western blot检测技术。原有的Western blot技术所用的抗原是通过病毒感染哺乳动物细胞而分离获得，不可避免有细胞杂蛋白干扰。而应用重组蛋白作为抗原，成分专一，可保证检测结果的高度特异，还能避免将活毒应用于检测试验所可能带来的散毒危险。
第六节核酸序列分析
核酸是生命的遗传物质，遗传信息存在于4种单核苷酸（A，G，C，T/U）按不同顺序连接而成的核酸分子中，迅速准确地解读决定生命性状的密码，测定基因组的核酸序列，对于识别病原，揭示疫病变化规律是其他任何方法都无法比拟的，但它也是最烦琐和最复杂的检测技术，目前在动物检疫中尚不多采用，但有时是必须且正日益变得常用。
目前应用最多的快速测序技术是Sanger等（1997）提出的双脱氧链终止法。其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺人链端，该链就停止延长，链端掺人单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5‘端，以双脱氧碱基为3”端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成的碱基排列顺序。
一、Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP，包括放射性标记dATP，例如a32PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板、则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5‘端向3’端端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺人时，由于它在3‘端位置没有羟基，故不与一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺人，因而产生一系列没长度的新的DNA链。
