4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。
二、双脱氧测序的示例及具体操作步骤
1.变性双链模板的制备
1.1材料：Tris/葡萄糖缓冲液（20mmol/L Tns-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA.50mmol/L葡萄糖），1％SDS，0.2mol/L NaOH，异丙醇，TE缓冲液pH8.0，4mol/L LiC1，冷70％乙醇无水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。
1.2配制方法：
1.2.1取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150ul Tris/萄萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5min。
1.2.2加入300L的1％SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15min，加入225ul 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45min，然后离心5min；
1.2.3将65ul上清液转移至一支新管中，加入650u1异丙醇，混合后在室温下放置10min，离心5min后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀；
1.2.4用125ulTE（pH8.0）重新溶解DNA，加入375u1的4mol/L LiCl，在冰浴中20min后，于4℃下离心5min；
1.2.5将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30min，离心5min，弃去上清液；
1.2.6用冰冷的70％乙醇洗沉淀，离心5min，弃去上清液并干燥，用50u1TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量；
1.2.7取0.2g质粒DNA，并将体积调至9ul，加入lul 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5min，加入2ul 30mol/L醋酸钠（pH4.5）和8ul水；1.2.8加入6ul冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15min，在4℃下离心5min，小心地弃去上清液，用冰冷的70％乙醇洗沉淀，离心5rain并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。
2.延伸和终止反应以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。
2.1材料：变性的双链DNA模板（溶解在TE缓冲液中），0.5pmol/ul寡核苷酸引物（溶解在TE中，-20℃贮存），5×测序缓冲液（200mmol/L Tris pH7.5，50mmol/L MgCl2，-20℃贮存），0.1mol/L DTT（当月新配-20℃贮存），15mol/L的3种dNTP混合物（缺dATP），1000至1500Ci/mmol a32P dATP （在-20℃下达4至6周），修饰的T7DNA聚合酶，标准酶稀释溶液（20mmol/L Tris－HCl pH7.5，0.5mg/ml BSA，10mmol/Lβ-巯基乙醇，4℃贮存），终止混合物，甲酰胺上样缓冲液（0.2ml 0.5mol/L EDTA pH8.0，10mg溴酚蓝，10mg二甲苯青，10ml甲酰胺）。
2.2配制方法：取4支0.5ml离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ul变性的双链DNA模板（分别为1和ug），lul寡核苷酸引物和2ul 5×测序缓冲液混合，65℃保温2min。在室温下冷却30min；
2.3每管加入lul 0.1mol/L DTT，2ul/11.5umol/L）3种dNTP混合物，0.5ul a32PdATP和2ul（2IU）修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5min；
2.3按标记每管分别加入3ul4种ddNTP终止混合物的一种；
2.4短促离心后，在37℃下保温5min；
2.5加入5ul甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2min，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ul，上样电泳。
3.测序反应物电泳和序列读取
3.1按普通聚丙烯酰胺凝胶制备方法制作梯度胶；
3.2按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T种泳道上样lul，而在C泳道上样1.5ul；
3.3上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间；
3.4电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30min脱去尿素；
3.5在60℃或80℃干燥30min，放射自显影读取序列。
三、研究进展
1.几种快速获取模板的方法：
1.1单链噬菌体系统：利用克隆载体M13噬菌体浸染大肠杆菌，在细菌细胞噬菌体基因组以复制型双链DAN存在，并经滚环式复制产生子代噬菌体正链DNA，同时合成有关蛋白，装配后释放到细胞外。成熟的M13噬菌体含单链DNA，经克隆的筛选、抽提纯化，得到所需模板。
1.2杂交质粒系统：此系统除具M13系统的功能外，还能作为表达载体直接用于DNA序列分析和基因表达研究。
1.3直接利用RNA进行序列测定：在杂交质粒的多克隆位点两侧插人一段能被噬菌体RNA聚合酶识别的启动子，在噬菌体RNA聚合酶的作用下，在体外将克隆的外源双链DNA转录为单链的RNA，以RNA为模板，与引物退火后，在反转录酶（如AMV）作用下，按双脱氧链终止法步骤进行序列分析。
1.4PCR技术的采用：PCR技术的出现，使序列分析用DNA模板的制备更加方便。①例如用PCR法合成双链DAN片段，直接用双链进行测序。②在PCR扩增时，两个引物之一的5‘端生物素化，扩增后将DNA变性，通过亲和素柱，分离5’端含生物素的单链。③利用不对称PCR，按1：50匹配两引物含量，产生单链DNA。④GAMTS法，在两个PCR引物之一的5端连接噬菌体RNA聚合酶启动子序列，这样经PCR扩增产生的双链DNA片段的一端就带上了该启动子序列。然后以扩增出的双链DNA为模板，在噬菌体RNA聚合酶作用下转录出单链RNA。再以单链RNA为模板进行序列分析。
2.采用高分辨率的凝胶电泳技术：
2.1采用薄胶：凝胶厚度减少到0.5mm或0.1mm，样品泳动加快，自显影时减少β粒子在凝胶中的散射，提高分辨率。
2.2采用梯度胶：包括离子梯度和浓度梯度，使DNA片段泳动均匀，大小不同而又很相近的大片段更易拉开距离。
2.3采用鲨鱼齿梳：使相邻泳道相互靠近，不但在显影图上更易判定相邻带的上下关系，而且可以增加每板凝胶的泳道数目。
3.DNA序列分析自动化：
3.1放射自显影自动读谱仪：在电泳装置中装一个高灵敏度放射性探测仪，在电泳过程中将结果输入计算机，获得分析结果。
3.2用荧光标记引物或荧光标记ddNTP：可在电泳过程中以激光扫描装置识别DNA条带，经计算机处理后得到序列分析结果。此法适宜大量样品的测序。
