第1章 丙型肝炎病毒学、免疫学特征及分型 (2)
（4）P7蛋白：P7蛋白是从E2蛋白上切割下来的一段含有63个氨基酸的多肽，介于结构蛋白和非结构蛋白之间，位于基因组2580～2768nt，有2个跨膜结构区。跨膜区通过α螺旋结构2次跨膜，将P7定位于内质网膜上。由于HCV前体蛋白的加工是在宿主细胞的内膜系统上完成，因而膜定位作用对于非结构蛋白的加工和成熟尤为重要，可能是其加工成熟的前提条件。最近报道显示，P7的CBL（conserved basic loop）是3个氨基酸组成的保守环结构，具有离子通道活性，这种活性可被抗病毒药物金刚烷胺抑制。Griffin等的研究也证实，P7蛋白在HepG2细胞内可以形成六聚体，构成离子通道，说明P7属于病毒细胞外膜孔道蛋白家族（viroporin family），可能对于病毒的成熟和释放极为重要，同时可以作为抗病毒治疗的潜在靶位。对与HCV同属的牛腹泻病毒（BVDV）的研究发现，P7对病毒的装配、传染性以及子代病毒的产生十分重要，而对于RNA的复制并不是必需的。此外用细胞培养系统进行病毒扩增时，P7蛋白是不可缺少的。这些现象都说明，P7蛋白不影响HCV基因组的复制，但参与了HCV感染细胞的过程。
4.非结构蛋白区
（1）NS2：NS2基因位于HCV基因组2769～3419nt位点，编码217个氨基酸。NS2蛋白是1个强疏水性跨膜蛋白，它的C末端转运至ER腔中，而氨基端位于细胞腔。NS2作为1个跨膜蛋白，与HCV结构蛋白E1、E2和非结构蛋白如NS5A、NS5B都存在复杂的蛋白质之间的相互作用。NS2与NS3共同组成具有自我切割功能的NS2-3蛋白酶复合体。NS2-3蛋白酶可以将NS2与NS3从其连接处切开，从而释放成熟的非结构蛋白。目前对于NS2从NS2-NS3复合体上切割下来后的功能还不清楚。有报道指出，HCV NS2蛋白通过抑制凋亡诱导因子CIDE-B介导释放的细胞色素C的活性，阻碍CIDE2B诱导的细胞凋亡途径，参与HCV对宿主细胞的防御。
（2）NS3-NS4A复合物：NS3基因位于HCV基因组3420～5312nt位点，编码631个氨基酸，分子质量约60kDa，具有NS2-3蛋白酶活性、丝氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性和NTP酶活性。其氨基末端1/3序列是丝氨酸蛋白酶活性结构区，其余部分是NTP酶和RNA解旋酶活性部分。丝氨酸蛋白酶催化NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B的裂解。NS4A蛋白的基因位于基因组5 313～5 474nt位点，由54个氨基酸组成。其作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，与NS3形成稳定的蛋白复合物，对丝氨酸蛋白酶活性有重要的调节作用。NS3的丝氨酸蛋白酶通过抑制RIG-1a和TLR3信号系统影响宿主细胞的防御反应，为抗病毒药物提供了新的靶位。
NS3或NS4A蛋白酶可完全抑制K1271或MAVS诱导的干扰素调节因子3（inteferon regulatory factor-3，IRF-3）和IRF27磷酸化，阻碍IRF应答。NS3氨基端可和抑癌基因P53形成复合物，阻碍其基因功能，抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡，并可导致细胞的恶性转化。针对慢性丙型肝炎患者应用的丝氨酸蛋白酶抑制药可以有效地抑制病毒的复制。此外，NS3氨基端120个残基与HCV相关肿瘤的发生关系密切。最近报道，NS3 L106A和F43A位点突变可抑制丝氨酸蛋白酶活性，并阻碍NS3-P53复合物形成，可能成为抑制HCV复制及致癌性的新靶位。NS3的解旋酶或NTP酶活性对于HCV的RNA复制非常重要，可以解旋双链RNA，消除RNA的二级结构，使RNA从核酸结合蛋白中分离出来，因此也成为抗病毒治疗的新靶点。
（3）NS4B：NS4B位于基因组5475～6257nt位点，编码261个氨基酸，是一种高度疏水的蛋白，至少4个跨膜区，是膜相关定位蛋白。其主要作用包括抑制翻译，调节NS5B RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的活性，引起细胞转化，诱导细胞非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）等。NS4B主要集中在内质网腔中，可以诱导内质网膜的网状改变，为病毒复制复合体的形成提供支架。
Elazar等报道，NS4B可调节膜相关物、复制复合体和HCV RNA的正确定位。同时NS4B在HCV的致病，特别是致肝细胞癌变过程中起一定的作用，HCV NS4B通过ATF6（activating transcription factor 6）或XBP1（Xboxbinding protein）途径引起内质网压力，导致细胞发生非折叠蛋白反应，使机体发生肿瘤的可能性大大增加。国内吕琪等采用DNA微点阵分析法，通过HCV NS4B稳定转染细胞对HCV NS4B与信号传导相关基因表达之间的关系进行研究发现，大部分原癌基因表达上调，而大部分抑癌基因下调，进一步证实NS4B在致癌过程中的作用。
（4）NS5A：NS5A蛋白位于基因组6258～7601nt位点，编码448个氨基酸，是高度磷酸化的非结构蛋白。目前发现，它参与了HCV多种蛋白的成熟和RNA复制并调控宿主细胞多种基因表达，刺激细胞增殖，抑制细胞凋亡以及影响干扰素疗效。NS5A可以特异性的和膜结合蛋白hVAP233结合，同时hVAP233还和HCV复制过程中的核心酶RdRp结合，说明NS5A可能是复制酶复合体的组成部分。NS5A高度磷酸化在控制HCV RNA复制过程中起着关键的作用。
Lohmann等对26个独立的复制子细胞克隆进行了序列分析，发现多数保守性突变主要聚集于NS5A丝氨酸（该蛋白高度磷酸化所需）富集的中心区域，并且NS5A适应性变异增强了HCV复制子的复制能力，S2197F、S2204I、S2202L是3个独特的NS5A变异位点，其子代复制子转染Huh27细胞，产生的集落形成效率明显高于亲代复制子，说明NS5A在HCV的复制中起着重要的作用。NS5A可激活多种转录因子如NF-κβ、STAT-3、SRCAP、PCNA的活性，影响P53的功能，抑制内源性和外源性P53对P21启动子的激活作用，阻碍其介导的细胞凋亡作用。NS5A还可抑制双链RNA依赖蛋白激酶（ds RNA dependent protein kinase，PKR），使细胞增殖失控，最终导致细胞的恶性转化，并能在裸鼠体内形成肿瘤。
NS5A可影响IFN的应答，并是α-IFN干扰素治疗成功率低的原因之一。干扰素敏感决定区域（interferon sensitivity determining region，ISDR）的突变和INF治疗敏感性之间存在一定关系。NS5A还可诱导白细胞介素（IL）28的表达，使HCV对IFN的抗病毒作用产生抑制，同时ISDR可以通过与依赖RNA的蛋白激酶（PKR）结合抑制细胞对IFN的应答。目前，关于NS5A对IFN应答反应的影响已成为研究的热点。但国内针对HCV1b型ISDR动态研究，未发现ISDR与干扰素疗效的相关性。
（5）NS5B：HCV非结构蛋白5B（NS5B）位于病毒基因组的7602～9371核苷酸位点，编码591个氨基酸蛋白，具有依赖于RdRp活性，RdRp是HCV RNA复制的关键酶。NS5B是一个尾部锚定蛋白（tailanchored protein）。其C端21个氨基酸区域疏水性较高，其中含有4个亮氨酸组成的基序（motif），在细胞中起到定位的作用，将NS5B蛋白锚定于近核周的内质网上，同时与NS5B的催化中心相互作用来调节NS5B的聚合酶活性。NS5B的三级结构包括手指（finger）、手掌（palm）和拇指（thumb）3种亚结构，其中含有大量的活性位点，为抗HCV药物研究的重要靶位。NS5B区具有HLA限制的杀伤性淋巴细胞识别位点，可使HCV逃避宿主淋巴细胞的攻击。
由于干扰素的治疗不可能完全脱离机体的免疫机制，所以T淋巴细胞位点变化可影响干扰素的治疗效果。此外，NS5B蛋白参与细胞生长调节。You等的一项研究显示，在肝癌细胞株中NS5B蛋白以不依赖P53表达的方式调节细胞增殖。并且HCV NS5B蛋白通过反式激活方式激活RPL5、CDC42、Securin、KRAS2、脯氨酸4-羟化酶、hVAP233等细胞生长调节因子的表达水平，参与细胞周期调节，细胞恶性转化，细胞信号转导等过程，提示NS5B蛋白在丙型肝炎向肝纤维化及肝细胞癌转归过程中发挥了一定的作用。NS5B还影响机体的免疫功能。它与hVAP33结合，下调一些蛋白在细胞膜表面的表达，如MHC21细胞膜表面表达的减少，降低了宿主细胞的抗原呈递，抑制了CTL对病毒的清除作用，促进HCV的持续感染。
