第3章 丙型肝炎病毒学免疫学特征及分型 (3)

第1章 丙型肝炎病毒学、免疫学特征及分型 (3)

5.展望目前，利用各种模型系统对HCV及其多种病毒蛋白研究已经取得了巨大的进展，但是对其各种蛋白功能的了解仍需进一步深入。HCV病毒颗粒的结构，复制的调控机制、完整的生活史以及致病机制等研究工作都需要不断地探索。对HCV分子生物学研究的不断深入将有助于设计出新型有效的抗HCV药物及针对HCV的治疗方法，并为疫苗的研究提供理论基础。

（段学章）

二、 丙型肝炎病毒感染的免疫学特征及免疫逃逸

HCV感染人体后易发生慢性化，不易为人体的免疫系统清除。急性感染HCV后80％左右的患者转为慢性，仅有少部分患者可自发清除病毒。目前对于HCV易于慢性化的机制仍不十分清楚，其中的原因可能如下：HCV在人体内复制率高，约1012copies/d；其RNA多聚酶缺乏校正功能，易导致HCV变异，使得免疫逃逸易于发生。此外，HCV病毒复制复合体似乎形成一个坚硬的膜性结构，在体外该结构可耐受蛋白酶和核酸酶的作用，防止病毒dsRNA被机体的天然免疫系统识别。

在对慢性HCV感染患者、实验感染HCV黑猩猩模型以及可短暂表达HCV一个或多个HCV蛋白的转染细胞的研究中发现，HCV可通过多种途径来逃逸机体的免疫监视，包括病毒的高变性、病毒基因编码产物对机体免疫应答的损害以及HCV在多脏器的感染等。现分述如下。

1. HCV感染后的免疫应答宿主感染病毒后机体的免疫应答主要有先天性和获得性免疫应答。先天性免疫应答主要包括机体的物理屏障、免疫细胞，如NK细胞、巨噬细胞等，以及一些可溶性的成分，如补体、干扰素（IFN）等。获得性免疫主要包括体液免疫和细胞免疫。

（1）先天性免疫应答：HCV感染后，先天性免疫应答是第一道防线。但由于急性HCV感染多表现为无症状，因此目前关于人急性感染HCV后先天性免疫应答的状况比较缺乏。但在许多动物实验中发现，不论机体最终是否清除病毒，HCV感染早期均可诱导较强的天然免疫应答，如Ⅰ类IFN的分泌等，这说明在HCV感染早期，Ⅰ类IFN的分泌可能会限制病毒的过度复制，但并不能完全清除病毒。这可能与HCV本身的多种抗IFN机制有关。同样，NK细胞功能在HCV感染后同样受到损害，这在HCV感染后易于慢性化的机制中起一定作用。

（2）体液免疫应答：中和性抗体可直接抑制病毒与宿主细胞的结合以阻止感染扩散，也可干扰病毒进入宿主细胞以及病毒基因组的转录，此外还可通过调理作用增强巨噬细胞对于病毒颗粒的吞噬，因此在抗病毒中起重要作用。

HCV感染后诱导机体产生许多针对HCV结构蛋白和非结构蛋白的抗体，可在感染后4~14周检测到。但是对于这些抗体是否具有中和病毒的作用，目前仍有争论。虽然所有免疫功能正常的人感染HCV后均产生抗体，但绝大部分不能清除病毒，因此提示抗体在病毒清除中的作用不大。但在最近的研究中报道，在HCV感染早期诱导产生中和性抗体的患者，病毒逐渐被清除。在对1例HCV急性感染患者随访6个月当中发现，病毒载量与中和性抗体滴度呈负相关。但值得注意的是，也有患者即使在感染早期不能检测到中和性抗体，也可清除病毒。因此这些研究提示，虽然目前不能明确抗体在HCV感染中的作用，但感染早期强大的中和性抗体可能有助于控制病毒复制，并辅助细胞免疫清除病毒。

（3）细胞免疫：细胞免疫的效应细胞主要有CD+4以及CD+8T淋巴细胞。CD+4T淋巴细胞识别抗原提呈细胞（APC）表面MHC Ⅱ类分子结合的抗原，而CD+8T淋巴细胞识别感染细胞表面MHC Ⅰ类分子结合的抗原。效应CD+4T淋巴细胞具有多种功能，可激活巨噬细胞、抗原特异性B淋巴细胞以及CD+8T淋巴细胞。激活后，CD+8T淋巴细胞可通过分泌穿孔素或通过Fas-Fas配体等机制杀伤感染细胞，也可通过分泌IFNγ以及TNFα抑制病毒复制，但并不引起感染细胞的死亡。

在急性HCV感染后，即使出现了抗体，HCV病毒仍持续存在，肝脏损伤进行性发展，研究证实在慢性HCV感染患者中，CD+4、CD+8 T淋巴细胞反应强度明显低于急性HCV感染后自发恢复的患者，因此提示细胞免疫反应可能在清除HCV中起重要作用。

HCV特异性T淋巴细胞在感染后5~9周出现，在对于急性HCV感染的患者研究中发现，HCV的自发清除与强烈、多特异性以及持续的CD+4T淋巴细胞反应有关。同样，也检测到了强烈的、多特异性的CD+8T淋巴细胞，可针对HCV的8~12个表位。在对1例由于针刺感染HCV患者的分析中发现，在暴露后第7周，病毒特异性的CD+8T淋巴细胞的出现伴随肝脏损伤的出现，但病毒的载量未见明显下降，而且在该期病毒特异性的CD+8T淋巴细胞不能分泌IFNγ。在后期，当CD+8T淋巴细胞恢复了分泌IFNγ的功能后，病毒滴度随之下降，肝脏损伤缓解。此外，在对急性HCV感染实验黑猩猩的研究中发现，感染后8~14周，病毒特异性的CD+4以及CD+8T淋巴细胞聚集在肝脏，伴随着肝脏损伤和病毒清除。因此以上研究提示在急性感染期，病毒特异性CD+8T淋巴细胞可能通过细胞毒及非细胞毒的作用来清除病毒，在机体抗HCV中起着重要作用。

2. HCV免疫逃逸机制HCV感染后，机体的免疫系统不能清除病毒，可能与HCV的逃逸机制有关。国内外许多学者研究表明，在慢性HCV感染患者，机体免疫功能发生障碍，表现在对其他病原微生物的易感性增强。此外，病毒变异、病毒基因产物对机体免疫系统的损害等多种因素也影响机体对HCV的清除。

（1）病毒变异：HCV为单股正链RNA病毒，基因发生突变的频率较高，在机体免疫系统及药物等选择压力作用下，病毒基因编码的抗原不断发生变异，产生新的HCV准毒株，以逃避宿主的免疫监视，这是导致HCV持续感染和慢性化的一个主要原因。其变异主要包括有中和性表位变异和CTL抗原表位变异。

①中和性表位的变异：中和性表位具有中和调理病毒的作用，HCV的高变异性使得机体产生的抗体不能有效地中和病毒颗粒，病毒难以被及时清除。位于HCV E2蛋白N端的高变区1（HVR1），为HCV外膜结构的暴露部分，也是表面抗原激发中和抗体最强的表位，应用体外结合中和试验（neutralization of binding，NOB）的方法可以检测到HCV感染者血清中的抗HCV中和抗体（抗-HVR1），这种抗体能够结合重组E2蛋白以及HCV样病毒颗粒。但目前尚不能确定这种抗体是否可以阻滞HCV病毒颗粒的入胞过程。有人观察到慢性丙型肝炎的自然消退与长时期高滴度中和抗体的存在有关，提示中和抗体在病毒清除过程中有一定作用。然而由于HCV感染模型的缺乏，这一理论并未能得到充分证实。HVR1具有高度的遗传变异性，研究表明，HVR1在宿主体内经历着快速的突变，其不断地变异往往是导致病毒持续感染的重要机制之一，而如果HVR1持续稳定，则病毒多被清除。

HVR1的变异能力与机体免疫系统及药物等选择压力有关。Booth等报道，同一基因型HCV感染，体液免疫功能受损者，其HVR1的变异性比免疫功能正常者要低，未应用干扰素（IFN）治疗者，HVR1的变异性比长期应用IFN治疗者要低。此外在急性感染时，HCV准种的异质性可预测感染者的预后，如果准种的异质性有限，感染被限制，病毒被清除。相反，若准种的异质性较高，病毒HVR1持续变异，将会导致感染的持续存在。

②CTL表位的变异：CTL对彻底清除和控制病毒的慢性感染起十分重要的作用，它能识别被MHC分子呈递的病毒蛋白分子中的T淋巴细胞表位。在自限型急性感染中，可以观察到持续而强烈的针对多个抗原表位的CTL作用。但如果病毒在体内繁殖过程中的基因突变改变了原来的T淋巴细胞表位，使得这个新的肽段或者不再能与宿主的MHC分子结合，或者结合了也不能为T淋巴细胞识别，病毒突变株便能暂时避开CTL的作用，获得亲代株所没有的繁殖优势。

在慢性HCV感染患者和实验黑猩猩实验中已观察到CD+4、CD+8T细胞表位的变异，这一结果示，HCV感染宿主细胞后，在机体免疫压力下，CTL结合表位发生变异，以逃避淋巴细胞的细胞毒作用。但有趣的是在对慢性HCV感染患者的随访中发现，逃逸变异并不持续发展，提示T细胞抗原表位发生在感染早期。实验证明，在发生HCV持续感染的黑猩猩中，感染后16周就出现了多表位的变异，这些变异表位在随后的随访中持续稳定，再未出现新的变异。同时也未检测到针对变异表位的CD+8T细胞反应，产生这种现象的原因可能为在慢性HCV感染患者中缺少足够的CD+4T细胞的辅助作用或变异的表位不能有效刺激野生株特异性的T细胞扩增。此外Tsai等观察到一个重要的现象，有的HCV蛋白变异后能竞争性地结合T细胞受体，从而产生抑制CTL的作用。因此，在感染早期T细胞抗原识别位点的变异被认为是HCV持续感染的另一个重要因素。

但是，值得一提的是病毒变异在病毒持续感染中的重要性目前仍不十分明确。一方面，早期的针对HCV的CTL应答是多克隆和多特异性的，病毒变异发生在出现针对某一表位的CTL反应后，而这种反应在急性HCV感染中并不常见，而且机体产生针对病毒的CTL反应是多特异、多表位的，仅单一表位的变异并不足以使病毒持续存在。另一方面，慢性HCV感染患者特异性T细胞反应显著低于自发清除病毒的患者，而病毒却在这种情况下发生变异，而且根据CTL的克隆特性，一个或多个位点的变异可能并不影响CTL的识别功能。因此，HCV持续感染不能仅用变异来解释，病毒特异性T细胞反应低下在持续感染中可能也同样具有重要作用。

（2）机体免疫细胞功能受损 (1)

①NK细胞：当病毒入侵机体后，NK细胞通过细胞毒作用和分泌IFNγ在早期病毒清除中起重要作用。研究发现HCV E2蛋白与CD81结合可直接抑制NK细胞功能，CD81分子作为一种细胞表面黏附分子，通过与膜蛋白的相互作用，参与细胞的黏附、激活、信号转导、增殖和分化等多种功能。研究表明，E2蛋白与CD81分子的结合能抑制NK细胞的MHC非限制性细胞毒作用，并减少了NK细胞IFNγ的产生。NK细胞IFNγ产生的减少导致Th1/Th2比值失衡（Th1细胞的增殖受抑制，Th2细胞的增殖加速）。因此，HCV可能会通过这种作用来抑制NK细胞的抗病毒活性，从而使HCV逃逸机体的免疫监视。

②树突状细胞（dendritic cell，DC）：DC是机体中最重要的抗原提呈细胞，通过提呈抗原到MHC Ⅰ、Ⅱ类抗原激活Th和CTL应答。DC可分为髓样DC（mDC）和浆细胞样DC（pDC），不成熟mDC具有很强的抗原摄取和处理能力，但刺激T细胞的能力较低，而成熟DC则与之相反。已有研究表明，在慢性HCV感染患者中，DC功能障碍。在混合淋巴细胞反应中，慢性HCV感染患者DC虽然刺激T细胞功能正常，但其功能仍较正常人低下，主要表现在IFNγ和IL-12分泌不足，从而抑制其不能诱导Th1类免疫应答。此外Bain等报道，HCV感染者外周血树突状细胞虽然形态及摄取抗原能力正常，但刺激T细胞增殖能力较正常人明显降低。因此，在慢性HCV感染患者中，DC功能的损害是多方面的，可以表现在抗原的摄取、提呈和刺激T细胞增殖等多个方面。

③T淋巴细胞：HCV特异性T淋巴细胞应答在清除病毒中起重要作用，Cucchiarini等研究发现在HCV急性感染期，感染者体内HCV特异性CD+8T细胞免疫反应的强度和广度与病毒载量呈负相关，提示细胞免疫对于清除HCV感染至关重要。事实上在慢性感染患者中，HCV特异性T细胞的损害可表现在细胞增殖、细胞毒作用以及IFNγ、TNFα等细胞因子分泌的功能上。

高病毒载量：小鼠模型已经证实高病毒载量可以导致T细胞无应答，病毒特异性T淋巴细胞在抗原刺激下不能分泌IFNγ。但到目前为止，针对HCV感染后病毒载量对T淋巴细胞功能的影响尚不十分明确。但是在对IFNα和利巴韦林联合治疗的患者研究中发现，治疗后随病毒水平的下降，CD+4T淋巴细胞的增生能力明显提高，间接提示：高病毒载量可能会抑制病毒特异性CD+4T淋巴细胞的增生。但是尚没有病毒载量抑制CD+8T淋巴细胞的证据。另外，也不能完全排除IFNα/利巴韦林联合治疗后CD+4T淋巴细胞增生能力的提高与IFNα本身对于机体免疫应答的激活作用有关，也未发现病毒载量下降后，病毒蛋白对于免疫应答抑制减弱。

T淋巴细胞成熟障碍：有研究表明在HCV等病毒感染后，病毒特异性CD+8T淋巴细胞成熟障碍。目前，主要通过检测T淋巴细胞表面趋化因子受体7（CCR7）和CD45RA或共刺激分子CD28/CD27的表达来确定其分化状态。虽然在CMV感染患者，特异性CD+8T淋巴细胞表型为高分化（CCR-7CD45RA+，CD-28CD-27），但HIV、HCV感染后，病毒特异性CD+8T淋巴细胞则表现为低分化状态。比如，HCV特异性CD+8T淋巴细胞多为CD+28和（或）CD+27，表明其仍处于早期分化状态。另外在HCV感染患者，不仅HCV特异性CD+8T淋巴细胞，而且CMV特异性CD+8T淋巴细胞均表现为低分化，提示HCV可能对CD+8T淋巴细胞有广泛的影响。

病毒因素对T细胞功能的抑制：HCV基因产物具有免疫调节功能。感染HCV的肝细胞和淋巴细胞表面表达的核心蛋白可与TNF受体和Fas相互作用，从而调节细胞凋亡。细胞外核心蛋白可与表达于初始T淋巴细胞、DC以及巨噬细胞表面的补体受体gC1qR相互作用而抑制T细胞的激活、增生和IFNγ的产生，从而对CD+8T细胞功能产生直接抑制作用。这种抑制作用可能与对细胞信号转导通路的影响有关，特别是IL-2的分泌障碍有关，因为加入外源性IL-2，这种抑制作用可被逆转。

调节性T细胞对T细胞功能的抑制：最近研究表明，不同亚型的调节性T淋巴细胞在病毒特异性T淋巴细胞的功能障碍和HCV持续感染中起一定作用。CD+4CD+25T淋巴细胞在体外可抑制慢性感染患者病毒特异性T淋巴细胞IFNγ的分泌。进一步的研究表明，CD+4CD+25T淋巴细胞的激活可抑制病毒特异性T淋巴细胞的增生，并表现为剂量依赖性。CD+4CD+25T淋巴细胞在HCV慢性感染患者中显著增加，约2倍于正常人，进一步说明了CD+4CD+25T淋巴细胞在HCV感染中的重要性。此外，Barnaba V等发现了另一亚群的调节性T淋巴细胞，即在肝脏内具有一种识别抗原后产生IL-10的CD+8T淋巴细胞，其可抑制病毒特异性CD+8T淋巴细胞分泌IFNγ。因此，肝内分泌IL-10的CD+8调节性T淋巴细胞损伤了肝内CD+8T细胞的抗病毒作用，从而使病毒易于持续存在。

（3）HCV基因产物对机体免疫应答的影响：目前研究证实，HCV的结构蛋白和非结构蛋白均可干扰宿主的免疫功能，特别是干扰宿主细胞内抗病毒信号转导通路，从而导致机体免疫系统不能完全清除病毒。

①与肿瘤坏死因子α（TNF-α）受体家族的相互作用：HCV的核心蛋白可通过与肿瘤坏死因子受体（TNF-R）家族以及蛋白-双链RNA依赖性蛋白激酶（the double2stranded RNA2activated kinase，PKR）的相互作用调节细胞的凋亡，影响机体清除HCV感染的细胞，使HCV感染慢性化。实验表明，HCV核心蛋白的N末端可以与TNFR家族成员淋巴毒素b受体（LTbR）结合，作用位点与LTbR和肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor2 associated factor，TRAF23）作用的位点相同，并且核心蛋白和LTbR的结合也可引起类似的生物活性，触发细胞裂解活性以及核转录因子NF-κB活性。这些发现提示HCV核心蛋白可以激活LTbR的生物功能，促进感染HCV细胞的凋亡。但因为HCV可感染淋巴细胞，因此可通过促进淋巴细胞的凋亡来抑制机体的免疫功能。在慢性感染中，外周血HCV特异性的细胞毒作用很弱，可能就是因为活化的CTL自身凋亡增强所致。

Delhem等报道，核心蛋白也可调节PKR诱导的凋亡作用。体外实验表明，应用肝细胞癌HCV分离株表达的重组核心蛋白可以激活PKR而致感染细胞凋亡。普通感染细胞凋亡的增强可以抑制病毒的复制和存在，但免疫细胞凋亡的增强，将导致机体免疫功能下降，使病毒难以被清除。

②对于IFN抗病毒作用的影响：HCV E2蛋白可结合并抑制PKR的活化。这是因为E2中存在与PKR及eIF2α磷酸化位点（PePHD）的同源序列。E2在体外实验中可以通过与eIF2α的PKR磷酸化位点结合，阻断eIF2α的磷酸化，抑制IFN引起的级联式酶促反应，降低PKR的活性，使得机体的抗病毒反应不能清除病毒。不同基因型的HCV E2蛋白与PePHD同源性有较大差异，这可能就是不同基因型的HCV对IFN治疗反应不同的原因。E2蛋白亦可以导致内质网应激，影响细胞膜表面分子的表达，从而进一步影响机体免疫系统对于感染病毒细胞的识别和效应细胞的激活。

IRF-3是细胞抗病毒反应过程中的一个重要转录因子，它的活化可诱导IFN-α转录和分泌，并可直接刺激一些IFN效应基因转录，如ISG56和ISG54。HCV的丝氨酸蛋白酶NS3/NS4A可能通过切割一个或多个未知的宿主细胞IRF-3信号转导通路中的靶蛋白分子，进而阻断病毒感染所诱发的IRF-3活化，抑制宿主的免疫反应。

NS5A蛋白C末端的一段序列与IFN耐药性有关，被称为干扰素敏感性决定区（IFN sensitivity determining region，ISDR）。对感染人体HCV的核苷酸及氨基酸序列进行动态观察，发现IFN治疗后NS5A区核苷酸及氨基酸序列均发生了变化，说明IFN治疗对病毒序列有选择作用，产生了新的优势株，即引起了其准种的改变。Gale等报道，HCV基因型1a和1b感染患者中，在IFN治疗无效的HCV毒株中分离出的NS5A蛋白C末端可以与PKR直接作用，抑制PKR活性。这种作用现被认为可能是NS5A变异导致IFN耐药的主要原因。Polyak等在体外实验中发现NS5A可刺激IL-8mRNA转录和分泌，而用IL-8预处理体外培养的细胞也可抑制IFN的抗病毒效果。一项血清流行病学调查表明，在IFN治疗无应答的丙型肝炎患者血清中，IL-8的水平显著高于完全应答者。这些都提示NS5A蛋白可能通过诱生IL-8来削弱IFN的抗病毒作用。

③对于细胞表面分子表达的影响：NS5B是HCV复制所必需的依赖于RNA的RNA聚合酶。NS5B与其他NS蛋白结合形成复合物，以病毒正链RNA为模板合成负链RNA。NS5B有膜锚基位点，可以固定在胞浆内质网上，因此NS5B可以与囊泡转运蛋白hVAP33结合，下调一些蛋白如MHC Ⅰ类分子在细胞膜表面的表达。MHC Ⅰ类分子在细胞膜表面表达的减少，降低了宿主细胞的抗原呈递，抑制了CTL对病毒的清除作用。

总之，HCV病毒蛋白可以通过多种途径来影响机体的免疫功能，使得病毒可以逃逸免疫系统对其的清除作用，使病毒在宿主中持续复制，最终导致HCV感染的慢性化。HCV基因型1a和1b亚型的E2和NS5A蛋白可以干扰IFN的应答，使病毒逃脱机体非特异性免疫反应，并导致IFN耐药。NS3/NS4A阻断病毒感染所诱发的IRF-3活化，抑制宿主的免疫反应。NS5B可下调MHC分子的表达，抑制T淋巴细胞的细胞毒作用，降低机体对感染HCV细胞的清除。在这些机制的共同作用或协同作用下，HCV得以持续存在。

（苏海滨）

三、 丙型肝炎病毒的分型和准种

丙型肝炎病毒的分型和准种均是由于病毒的基因复制特点决定的，是一个问题的两个方面。由于HCV的RNA依赖的RNA聚合酶（NS5B）缺乏校读活性以及HCV的高复制率，不同HCV毒株间基因组有较高的变异。当不同HCV基因组间的核苷酸变异达28％以上时，可将其归为不同的型（types），当不同HCV基因组间的序列变异低于28％但高于10％时，则将其分为不同的亚型（subtypes）。而准种则是同一亚型内的病毒基因组的微小差异造成的。

（2）机体免疫细胞功能受损 (2)

HCV感染宿主以后，在感染者体内变异，经若干时间，在感染者体内形成以一个主要序列为主的一群相关突变体病毒株，感染者体内的这种HCV状况称之为准种。准种现象增强了病毒的适应能力。同时存在的多个不同的基因组有利于突变株的快速选择以适应新的环境条件，最“适合”的毒株能够逃逸宿主的免疫压力导致感染的不断延续。当准种群中的其他准种被免疫系统控制时，任何一个准种都可能发展成为优势株。在这种情况下，中和抗体难以发挥应有的作用。如上所述，HCV在感染者体内的变异是形成准种的一个重要因素，已知HCV全基因组变异的平均速率在人体与黑猩猩体内分别为1.92×10-3nt/（位点·年）和1.44×10-3nt/（位点·年）。在HCV基因组内，不同基因区核苷酸的变异速率相差甚大，由（0~3.4）×10-3nt/（位点·年）不等。

1. HCV准种特性1971年Eigen等在描述地球早期生命演化时，启用了“准种”这一概念。以后人们在分析噬菌体Qβ群中单个病毒克隆的RNA时发现“准种”的确存在，并将其引入了病毒的研究，以求循一个新途径来解释和说明病毒的高度变异性问题。HCV属于单股正链RNA病毒，其基因组包膜糖蛋白区E2/NS1基因组C端相对保守，N端含有两个高变区域（hypervariable region，HVR）即HVR1（384～410/413 aa）和HVR2（474～480 aa）。

研究发现HVR1含有病毒株特异的中和性抗原表位，它的变异与丙肝慢性化及防治失败密切相关。HCV感染者体内可同时存在大量基因序列相关的HCV准种群体，而且会随病情和（或）病程不同而发生变化。这种序列异质性变异株可发生在HCV基因组的各区段，包括5′非编码区（5′UTR）、核心区（C区）、包膜区（E区）及非结构蛋白区（NS区）等均有报道。最近，Gerotto等报道了HCV-NS5A干扰素敏感决定区（IFN Sensitivitydetermining region，ISDR）准种特性，认为其会影响到HCV 1b型感染者对IFN治疗的应答。但有研究证实约20%序列变异发生在E2/NS1区，HCV准种株特性在HVR1表现较明显而更具有代表性。

2. HCV准种的量化随着分子生物学技术的广泛应用，目前主要以准种HCV基因的复杂性（complexity）或异质性（heterogeneity）程度来对其进行量化，主要有以下几种方法：①直接测序法。针对特定区段RNA序列进行体外反转录扩增（RT-PCR）得到相应的cDNA，然后用PCR扩增产物直接测序或克隆后测序，根据异质性序列种类（diversity）来评价该区段准种株多寡。②单链构象多态性分析法（singlestrand conformation polymophism analysis，SSCP）。此法是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法，将单链扩增DNA（引物已用放射性核素或荧光标记）通过中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和放射自显影，根据其SSCP条带数目及位置不同则可分辨出序列单个碱基和构型改变，由此来判断体内准种株的复杂程度。

③异源双链泳动分析法（heteroduplex mobility assay，HMA/heteroduplex gel shift analysis，GSA），亦称异源双链示踪检测法（heteroduplex tracking assay，HTA）。此法早期主要用于艾滋病病毒异质性研究，主要原理是基于DNA分子的变性和复性过程。

在DNA经过变性后复性时，如反应系统中存在两种或两种以上具有一定同源性的核酸分子链，不同来源的两链同源区可配对形成双链，此即异源双链；异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，分子构象发生了改变，不同于同源双链，通过非变性的PAGE，同源性越高，泳动就越快，反之则慢。比较而言，第一种方法结果直接而可靠，但较原始且费力费时，直接PCR产品克隆和序列分析往往不能代表HCV准种株的真实组成，虽容易鉴别出优势序列，但小的克隆很可能被忽略。PCR-SSCP法应用较广，但对低于5%的准种株病毒群体亦有可能检测不到，而且操作烦琐。相比之下，HMA法操作相对简单省时，可用于基因亚型的测定。这些方法学上的差异在一定程度上可能决定了各学者在研究HCV准种特性时某些结论的不一致，所以寻求一种更准确、简便而重复性较好的方法是必需的。

3. HCV准种的优势株与劣势株有研究认为对HCV准种群体变化可能有三种解释：①HCV变异是HCV感染人体后随时间变化而自发产生的；②病情严重时，HCV复制更加活跃，复制期间“易错配”（errorprone）的RNA聚合酶导致了序列变异；③正性免疫选择压力（positive immune selective pressure）作用所致病毒适应环境的结果。因此在大量的准种中，可能有一个或几个主序列，主序列代表特定环境下最适应的基因群。主序列与其他序列的关系也就构成了复杂的“优势株”与“劣势株”关系，而且很可能有序列优势株和功能优势株之别，它们与HCV感染后疾病的转归关系尚不清楚。Gretch等采用HTA方法观察了5例HCV-1型感染患者肝移植前后血清中HCV HVR1准种及优势株（major variants）的变化。

发现3例移植后再发严重肝病的患者，其移植前存在的优势株在移植后即出现了明显的复制增殖并伴随病情从急性发展为慢性；相反，在2例移植后发展为无症状的感染者体内，虽然病毒滴度仍高，但移植正常肝后原来的优势序列很快消失，而在30d左右即出现了新的HVR1准种株。序列分析发现，新的病毒准种株实际上来源于移植前就存在的次要变异株（＜5%HVR克隆）。作者认为HCV感染患者血清中有一种或多种优势变异株存在，与同时存在的其他次要株之间关系复杂，它们在肝组织嗜性、致病能力、肝外复制及免疫压力选择作用方面可能均不一致，从而联系到不同的疾病过程。国内潘文胜等对2例HCV持续感染患者5年的HVR基因变异研究发现：①HVR的变异具有高度复杂性，但不是杂乱无章，而是有规律地朝着一个方向发展，不管是感染早期的优势克隆或劣势克隆，随着病程发展，绝大多数均会消失，取而代之的是新的优势克隆；②HVR变异存在优势克隆劣转的现象，可能由于免疫系统首先攻击的主要对象是优势克隆，逃逸免疫清除的劣势克隆可优势化，这也解释了按优势克隆合成的多肽没有完全保护性的现象。

4. HCV准种的分布有研究表明，HCV可在肝外组织复制，Sakamoto等研究曾发现不同丙肝的临床病程中，患者肝组织及血浆中的HCV准种并无明显差异。但目前大部分学者认为其分布是不一致的，这种分布差异性具体机制尚不清楚；不过，肝外组织或细胞检出HCV准种均提示HCV感染，而不是简单的病毒吸附作用。这种异质性序列分布差异在用HCV感染黑猩猩时亦有报道，且某些有特别优势包括能逃逸宿主免疫和在某些组织内复制的HCV株可持续存在。Fujii等利用PCR-SSCP法，对11例慢性丙肝患者血清及外周血单个核细胞（PBMC）中的HVR1准种进行了比较研究，发现有4例（36%）血清及PBMC中的HVR1准种序列变异是一致的，2例（18%）HVR1准种群体和序列变异均不同，另外5例（45%）既未出现准种群体改变亦未出现HVR1序列变异。

提示HCV感染者血清及PBMC中有不同准种存在，而血清中HVR1准种明显多于PBMC可能因为暴露于宿主免疫的PBMC相对不如肝组织，从而产生免疫压力差异所致。Cabot等收集了39例HCV1b型感染的病情程度不同患者的肝组织，通过对其与血清中HCV E2-NS2段核苷酸和氨基酸复杂性比较，发现95%的患者相应的氨基酸序列是一致的；有26%的患者HCV准种复杂性血清中高于肝组织，28%的患者低于肝组织，41%的患者两者相同，同样认为可能与病毒在肝细胞内复制和血浆中循环的选择性压力不同有关。早些时候Maggi等研究比较了10例丙肝患者肝组织、PBMC及血浆中HCV E2或NS1区准种的分布情况，结果发现所有患者肝组织及PBMC中HCV准种株有明显不同。尽管在血浆中有肯定的HCV突变株存在，但存在于肝组织和（或）PBMC中的突变株并未在相应的血浆中检测到；另外亦未发现明显的特异性嗜组织株。而最近Laskus等研究则认为各种组织和PBMC可选择性吸附E2区不同的病毒亚群，从而影响到准种分布。

5.丙型肝炎病毒的分型对来自于全球的所有HCV毒株基因序列进行比较分析，可将它们分为6个基因型和至少50个基因亚型。以阿拉伯字母1、2、3等命名基因型，以其后小写的英文字母a、b、c表明基因亚型，如1a、1b、2a、3a等。

HCV基因型的分布有一定的地理特征，基因型1a、1b、2a、2b、2c和3a呈全球流行，尤以1b全球流行最为广泛，1a和1b主要流行于北美和欧洲；1b和2a主要流行于亚洲。有些基因型只在局部地区流行，如基因4a型流行于埃及和中非，基因5a型流行于南非，基因6a型流行于我国香港、澳门和越南北部。在我国肝病患者中流行的主要基因型是1b和2a，在南方地区主要是基因1b型，占90％以上，从南方到北方，基因2a型逐渐增多，可达50％，而基因1a型和基因2b型仅有散在的报道，流行人群尚不清楚。其他与感染人群有密切关系的是，基因1a型和3a型流行于静脉药瘾者，基因4a型在该人群中的流行也在逐渐增高。

目前HCV的分型方法主要有PCR依赖的方法与血清学方法两大类，基于5′UTR直接序列分析的基因分型和型特异性寡核苷酸探针的反向杂交均已标准化。

依靠PCR的分型方法能检出更多的基因亚型，血清学方法则对于一般临床检测，流行病学调查有着简便、经济、不易污染等优点。PCR分型方法与血清学分型方法结果的一致性可达88％左右。

在PCR分型方法中较广泛使用的是5′UTR扩增产物的限制性酶切长度多态性分析（RFLP），但5′UTR的RFLP有时不能精确分出基因亚型。因为在中国大陆主要以1b和2a型流行，所以在国内采用5′UTR的RFLP方法来分型尚有较高的实用价值。HCV基因型检测的应用需要依据其临床意义而定，在不同人类病毒感染性疾病中，基因型具有不同的临床意义，但并非与临床的各个方面都有关系。目前已明确HCV基因型与临床的关系主要在于对干扰素的敏感性。其中，基因1型感染者的干扰素应答率显著低于非基因1型，在聚乙二醇干扰素的治疗过程中，基因1型感染者需要1年疗程，而非基因1型则疗程可在6个月。因此在目前情况下，基因型的检测应该主要是区别基因1型与非基因1型。近来报道，基因4型感染者对干扰素的应答也较低，但该基因型只流行于非洲。

HCV基因分型的金标准是E1或非结构基因（NS）5B的序列分析并与参考序列的比较以及分子进化分析。临床的基因分型可以通过直接序列分析，型特异性寡核苷酸探针的反向杂交或限制性酶切长度多态性分析来确定。基于5′UTR直接序列分析的基因分型和型特异性寡核苷酸探针的反向杂交均已标准化，两种方法均能测定HCV的6个基因型和一系列基因亚型。对基因型的检测误差不多，但基因亚型的分型错误为10％~25％，这些错误并非由技术造成的，而是与所选择的测定基因区（5′UTR）有关。由于只有基因型与临床的关系密切，所以临床上也不需要检测基因亚型。

检测不同基因型的特异性抗体也可以进行基因分型，但不能区别不同的基因亚型。90％免疫功能相对正常的慢性感染者可以通过血清学方法鉴别基因型，与分子生物学方法的符合率达95％，对基因1型的检测效果优于其他基因型。对于血清学方法与分子生物学方法检测结果不一致的感染者，以E1或NS5B区基因的序列分析往往与分子生物学分型结果一致。血清学分型的另一个不足是检测结果有时表现为混合反应，此时不能区别是真正的混合感染抑或为交叉反应，也可能为一个基因型感染的恢复而另一个基因型感染持续存在的结果。

（陈玉琪 汤勃）