（第一节）双孢蘑菇菌种生产的设备
一、培养基配料设备
主要设备是搅拌机，用于双孢蘑菇原种和栽培种培养基配料时使用。
使用搅拌机代替手工拌料，能使培养料搅拌更均匀，效率更高，省工，降低劳动强度。
二、培养基分装设备
主要设备有装瓶机、装袋机和装瓶装袋机。
用于原种和栽培种生产时分装培养基，使培养基分装更标准，速度更快，劳动力更省，劳动强度更低。
三、培养基灭菌设备
主要设备有手提式高压灭菌锅、电热卧式高压灭菌锅、煤柴加热高压灭菌锅、锅炉高压蒸汽加热高压灭菌锅、常压灭菌灶等。
用于培养基和其他需要灭菌的物品的灭菌，杀死各种微生物和害虫，确保培养基和物品的无菌和无害虫。用高压设备灭菌时间短，灭菌更彻底。
四、菌种接种设备
主要设备有接种箱、超净工作台、无菌室。
接种箱基本是一个封闭的箱子，在接种前通过物理或化学的的方法，对接种箱和箱内培养基和物品进行消毒，使之成为无菌状态，然后在进行无菌操作接种，防止杂菌的污染。
超净工作台是一种提供局部无尘无菌工作环境的空气净化设备，利用超净工作台接种速度快，对工作人员无害，操作更轻松。
无菌室是通过化学灭菌和空气净化的技术，达到相对洁净和无菌的空间，在此空间进行接种，可容纳的培养基多，可多名工作人员在一起同时进行操作，接种速度快。但要经常保持无菌室的洁净。
五、菌种培养设备
主要设备有恒温培养箱、空调培养室、培养室消毒设备等。
恒温培养箱只有升温设备，没有制冷设备，主要用于母种或少量原种和栽培种在低温季节的培养。
空调培养室装有空调设备，可在任何季节和气候情况下培养菌种，可调节到菌丝需要的最佳温度进行培养，菌丝生长速度快、质量好。用于菌种规模化生产。
六、菌种保藏设备
主要设备有冰箱、冷冻干燥器、液氨生物容器等。
主要用于菌种的保藏，以使蘑菇种质资源不遗失。
（第二节）双孢蘑菇母种的生产
母种又叫一级种，可由自己分离培养获得或从专门从事菌种研究的部门购买。母种可以进行转管扩大繁殖，以增加母种数量，但是没有母种生产经验和缺乏母种质量鉴定能力的制种单位，不进行母种的生产。
一、生产工艺流程
菌种分离—培养基制备—培养基灭菌—培养基冷却—接种—菌丝体培养。
二、菌种分离
栽培双孢蘑菇菌种的最早来源都是从菌种分离开始的，所谓菌种分离就是从双孢蘑菇子实体收取孢子或提取组织、从双孢蘑菇生长的基质中提取菌丝进行纯化培养，从而获得纯双孢蘑菇菌丝体的菌种。双孢蘑菇菌种分离方法主要有孢子分离法、组织分离法、基质分离法三种。
1、孢子分离法
双孢蘑菇的孢子分离法，是通过选取成熟的子实体，在无菌的条件下弹射，然后接种在适宜的培养基上萌发出菌丝，从而获得纯菌种的方法。孢子分离法可分为单孢分离法和多孢分离法两种。生产上都采用多孢分离法分离菌种，以保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要用于菌株的筛选和杂交育种等方面。孢子分离法主要分为两个步骤：孢子采集和孢子分离（单孢分离和多孢分离）。
（1）孢子采集：
种菇选择：孢子采集首先要选好种菇，即采集孢子的子实体。种菇标准为：第一潮的菇，出菇早，单生，菇体健壮，具典型特征的子实体，确定种菇目标后，标上记号，待子实体生长至菌膜将破时采回，进行孢子采集。
孢子弹射收集：种菇采回后浸入0.1%的升汞溶液中消毒1分钟，然后用镊子取出经无菌水冲洗几次，再用无菌滤纸把表面水吸干，随后用无菌刀片切短菌柄（保留1.5—2cm），菇柄朝下插入铝线做的支架上，菇连同支架放入铺有无菌滤纸的培养皿内，盖上消毒过的玻璃钟罩。整套孢子收集装置都需经过高压灭菌消毒。把装有子实体的孢子收集器放置在15—20℃的环境下，经过24—48小时，培养皿无菌滤纸上可见咖啡色的双孢蘑菇孢子印。
（2）孢子分离：
多孢分离法：即把多个孢子接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯菌种的方法。这种方法基本上可以保持亲本的稳定性，操作也比较容易，在双孢蘑菇制种中较常用。
方法：
斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸上蘸取少许孢子，在PDA试管斜面培养基上自上而下划线，试管塞上棉塞后，置于24℃的恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（15—20小时），挑选萌发快、长势旺的菌落，转接于新的试管培养基上进行培养，培养成后即为母种。
涂布分离法：按无菌操作方法，取一小块有孢子的滤纸片，放入装有无菌水的三角瓶中，充分摇均匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的滴管，吸取孢子悬浮液，滴1—2滴到PDA试管或培养基皿培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布在试管的斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培养基上24℃恒温培养15—20小时萌发后，挑选萌发快、长势旺的菌落，转接到新的试管斜面培养基上，培养成后即为母种。
单孢分离法：即将采集到的孢子群单个分开进行培养，让它单独萌发菌丝而获得纯菌种的方法。单孢分离法操作比较复杂，在双孢蘑菇制种时不常用，主要用于菌株筛选和杂交育种方面，这里不做介绍。
2、组织分离法
组织分离法是利用双孢蘑菇子实体组织来分离获得纯菌种的方法。这种分离法是种无性繁殖的方法，类似于栽培红薯时用藤蔓做种苗的道理。这种分离法获得的菌种基本上可以保持亲本的生物学特性，且操作简单，取材广泛。具体方法如下：
（1）挑选种菇：与孢子分离法种菇要求相同。
（2）菇体消毒：将子实体菇柄基部切除，放到接种箱内，用75﹪酒精或升汞进行消毒。
（3）挑取组织：用手术刀在酒精灯火焰灭菌后，在长菇柄部位的中心纵切一刀，后用手掰开菌盖，用接种铲在菌柄和菌盖交界处切取小方块的组织，移接到PDA试管斜面培养基上，在24℃恒温培养，待组织块上长出菌丝后，选取无污染的试管即为纯菌种。
3、基质分离法
基质分离法是指在生长子实体的基质中进行菌丝分离，从而获得纯菌丝的方法。具体操作方法如下：
（1）取基质中与子实体菌根相连的菌丝体，尽可能取较干净的菌丝束。
（2）反复用无菌水冲洗菌丝束，后用无菌的棉花吸干水分。
（3）挑取菌丝束尖端的部分，接入加有细菌抑制剂（40mg/kg青霉素或链霉素）的培养基中。
（4）放在24℃恒温条件下培养，一般如无杂菌污染，3—4小时就可在分离物上看到绒毛状菌丝。
（5）菌丝经生物学鉴定和出菇试验，确定是否为双孢蘑菇菌丝。
三、培养基制备
1、培养基配方：双孢蘑菇母种生产常用的培养基配方为PDA配方：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂18—20克，水1000毫升。
2、制作方法：
（1）马铃薯去皮切成1—2毫米厚的薄片，称取200克，加水1000毫升，煮沸后文火煮30分钟。然后用8层的纱布过滤，滤液中加入预先浸泡拧干的琼脂，继续煮，并不断用玻璃棒搅拌直至琼脂完全溶化，加入葡萄糖搅均匀，最后用清水补足水1000毫升，即可进行分装。
（2）培养基分装：煮好的培养基应趁热分装入试管。用玻璃漏斗夹在滴定架上，下接一段乳胶管，用弹簧夹夹住胶管，左手握试管，右手控制培养基流量，每只试管装培养基量为试管长度的1/4左右。
（3）试管塞棉塞：用手把棉絮做成棉塞塞入试管，塞入试管中的部分约2厘米左右，外露部分为棉塞总长的1/3左右，棉塞的松紧度以手提棉花塞试管不脱落为度。
（4）培养基灭菌：将分装好的试管培养基用纱布按10根包扎成一捆，在棉塞上用牛皮纸包住，防止灭菌时湿了棉塞，随后放入手提式高压灭菌锅中进行灭菌，灭菌温度达到121℃时保持30分钟（具体操作按高压锅操作指南），后停火自然降压至0时，打开高压锅盖。
（5）培养基摆斜面冷却：将灭菌后试管趁热放入摆斜面的木框内的木条上，使试管成斜面状，试管培养基的斜面长度为试管长度的2/3，摆好斜面后试管上面盖一层保温棉被，防止试管冷却太快，产生太多的冷凝水。
（6）灭菌效果检验：随机抽取数根灭菌后试管培养基，放到25—30℃下空白培养3天，经检查没有污染杂菌后，才能接入双孢蘑菇菌种。
（7）接种：接种前把培养基、接种工具、菌种等放入接种箱进行消毒，然后按照无菌操作规程进行接种，具体操作方法可参考无菌操作规程。
